5个油茶无性系花粉贮藏特性及杂交亲和力的研究

查钱慧，谭 莎，黄永芳，洪文泓，杨亚慧，弓丽花

（华南农业大学a.林学与风景园林学院；b.广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642）

5个油茶无性系花粉贮藏特性及杂交亲和力的研究

查钱慧，谭 莎，黄永芳，洪文泓，杨亚慧，弓丽花

（华南农业大学a.林学与风景园林学院；b.广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642）

为了研究油茶花粉贮藏特性及品系间杂交亲和性规律，选取‘长林3号’、‘长林166号’、‘长林4号’、‘湘林8号’、‘岑软3号’共5个油茶无性系花粉进行贮藏特性及人工杂交亲和性研究，通过对不同贮藏条件下花粉萌发率的对比及不同杂交组合杂交座果率的统计与分析，发现随着贮藏时间延长，花粉生活力呈明显下降趋势，油茶花粉最佳贮藏方式为冷冻干燥贮藏，‘长林3号’、‘长林166号’油茶无性系花粉冷冻贮藏90d后花粉萌发率均具45%以上，室温干燥保存50d后花粉全部失活，低温干燥保存90d后花粉萌发率均比冷冻干燥保存下花粉萌发率低10%左右；6个杂交组合中亲和力较好的组合为：♀ 湘林8号×♂ 长林3号、♀ 长林4号×♂ 长林3号、♀ 湘林8号× ♂长林166号、♀ 长林166号×♂ 岑软3号3月份座果率分别为40%、44%、48%、52%。

花粉生活力；花粉贮藏；座果率；杂交亲和性

油茶Camellia oleifera是山茶科Theaceae山茶属Camellia油茶组Sect. Oleifera植物，其种子提取的茶油含90%以上不饱和脂肪酸，营养比例合理，有“东方橄榄油”之美称[1]。油茶良种选育旨在选育出产量和经济性状均良好的油茶无性系。油茶育种有农家优良品种选育、辐射育种、杂交育种等，其中杂交育种是油茶育种重要的途径之一[2]。

油茶杂交育种中常伴有花期不遇和远缘杂交等问题，需要创造延迟花粉生活力的贮藏条件，提高杂交坐果率[3]。影响花粉生活力因素有很多，其中贮藏方式和贮藏时间对花粉生活力影响显著[3-4]。目前已有对木犀Osmanthus fragrans、白花树Styrax tonkinensis、垂丝紫荆cercis racemosa、野牡丹Melastoma candidum、黄瓜cucumis sativu、椰子等植物进行花粉生活力保持及贮藏特性的研究[5-10]。有关油茶花粉的研究也有报道，主要集中在对花粉形态、花粉数量、花粉管萌发、花粉生活力检测方法等方面[11-13]，而对油茶长林系列无性系花粉贮藏特性及其杂交亲和力研究尚少。本试验选取‘长林3号’、‘长林166号’进行花粉贮藏条件和贮藏时间研究，选取 ‘长林3号’、‘长林166号’、 ‘长林4号’、‘湘林8号’、‘岑软3号’油茶无性系共设计6个杂交组合进行人工杂交试验，旨在为油茶花粉适宜贮藏条件探究提供理论依据，为解决油茶花期不一致和远距离杂交提供实际参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地设在广东省广州市增城区华南农业大学油茶良种繁育示范基地（北纬23°24′26″，东经113°64′16″），海拔为 85m 。属南亚热带海洋性季风气候。基地内油茶林为6年生，树高约2.8 m，冠幅约2.5 m。林地实行正常的抚育管理措施，每年冬季施肥一次，进行穴施且有机肥和化肥配合施用。

1.2 试验材料

选取‘长林3号’、‘长林166号’油茶新鲜花粉进行贮藏条件和时间研究，选取‘长林3号’、‘长林166号’、长林4号’、‘湘林8号’、‘岑软3号’油茶进行人工杂交亲和力研究。

1.3 试验方法

分别采集‘长林3号’、‘长林166号’2个油茶无性系待开花苞，室内室温下培养至花药裂开后搜集花粉，分装于指形管中贴好标签；测定2种油茶新鲜花粉的生活力，剩余分别于室温干燥（25℃）保存、低温干燥（4℃）保存、冷冻干燥（-20 ℃）保存，分别于贮存10 d、20 d、30 d、50 d、70 d、90 d时测定3种贮藏方式下的花粉生活力。（注： ‘岑软3号’油茶花粉生活力已测定过且公开发表，见讨论部分）

根据5个油茶无性系的优良性状，选择发育正常、生长健壮的植株作为杂交亲本，共设计6种亲本组合：♀ 湘林8号×♂ 长林3号、♀ 湘林8号×♂ 长林166号、♀ 长林4号×♂ 长林3号、♀ 长林4号×♂ 长林166号、♀ 长林166号×♂ 岑软3号、♀ 岑软3号×♂ 长林166号。每个杂交组合人工授粉50朵，另选取50朵待开放花蕾标记作自然对照。人工杂交选择在晴好天气的早晚进行，杂交授粉的时间为2012年11月13日，授粉后立即套袋，做好标记，5d后去袋并细致管理。

1.4 试验指标测定

花粉生活力均采用离体萌发法测定，具体方法为：配置培养基为0.01 %硼酸 + 0.03 %硝酸钙+ 0.02 %硫酸镁 + 0.01 %硝酸钾 + 15 %蔗糖 +1 %琼脂，将花粉置于培养基25℃黑暗条件下培养2 h以上，在10×10倍显微镜下检测花粉萌发，花粉管长度大于花粉直径视为花粉萌发，萌发率等于萌发的花粉数除以检测的花粉总数[14]。杂交后定时记录人工杂交和自然状态下的座果数，并计算座果率。

1.5 数据处理

数据统计分析和作图由Microsoft Excel和SPSS17.0 软件完成。

2 结果与分析

2.1 2种油茶无性系的新鲜花粉生活力

表1可知，‘长林166号’的新鲜花粉生活力为74.56%，‘长林3号’新鲜花粉生活力为67.40%。2个油茶无性系花粉生活力具显著性差异（p＜0.05）。不同品种的新鲜花粉生活力存在差异，这可能与其遗传物质差异有关。

表1 2种油茶的新鲜花粉生活力†Table 1 The fresh pollen viability of 2 Camellia oleifera species

2.2 不同贮藏方式和时间下2种油茶花粉生活力的变化规律

由图1 可知，随着贮藏时间延长，‘长林3号’油茶花粉在室温干燥、低温干燥及冷冻干燥条件保存，其花粉萌发率均呈下降趋势，其中室温干燥保存的花粉生活力下降速率最快，其在保存10 d后花粉的萌发率已经下降到50%以下，为42.21%，在30 d后花粉失活加快，至50 d时全部失活，无法萌发；低温干燥保存的花粉生活力下降速率居次，在保存20 d后下降到50%以下，为48.28%，保存90 d后花粉萌发率为30.87%；冷冻干燥条件保存下的花粉生活力下降速率最慢，保存10 d后花粉萌发率为61.98%，随后花粉生活力平缓下降，在90 d后下降至45.63%。

图1 不同贮藏条件和时间下长林3号油茶花粉生活力变化Fig.1 The diversification of pollen viability about ‘Changlin 3’ in different storage conditions at different times

由图2可知，随着贮藏时间延长，‘长林166号’花粉在室温干燥、低温干燥及冷冻干燥条件保存，其花粉生活力均呈下降趋势。3种贮藏条件下花粉萌发率下降速率从高到低为：室温干燥保存＞低温干燥保存＞冷冻干燥保存。室温干燥保存的花粉随着时间的增加其萌发率迅速下降，在50 d后花粉萌发率下降至0%；低温干燥和冷冻干燥保存的花粉萌发率下降速率相差不大 ，在保存10 d后花粉的萌发率分别为63.03%和68.48%，保存90 d后花粉萌发率分别下降至42.75%和47.73%。

图2 不同贮藏条件和时间下长林166号油茶花粉生活力变化Fig 2 The diversification of pollen viability about ‘Changlin 166’ in different storge conditions at different times

2.3 人工杂交坐果率与杂交亲和性分析

由表2 知，在人工杂交和自然杂交中，6个油茶杂交组合3月份坐果率相比1月份均有下降，这与油茶花期雨水过多，传粉受阻有关。1月份6个油茶杂交组合的人工授粉座果率均低于自然状态下座果率，其中座果率相差最大的为♀ 岑软3号×♂ 长林166号，其人工授粉座果率为50%，自然授粉座果率为96%，二者相差46%；座果率相差最小的为♀ 湘林8号×♂ 长林166号，其人工授粉座果率为74%，自然授粉座果率为76%，二者相差2%。3月份♀ 湘林8号×♂长林3号的人工座果率高于自然授粉坐果率，分别为40%和32%；其余5个油茶杂交组合的人工杂交坐果率均低于自然授粉座果率；其中3月份人工授粉座果率最高的是♀ 长林166号×♂ 岑软3号，为52%。自然授粉座果率最高的为♀ 岑软3号×♂ 长林166号，为94%。

表2 人工杂交与自然杂交的座果率Table 2 The fruit-set rate of artificial and natural hybridization

♀ 湘林8号×♂ 长林3号3月份人工授粉座果率比♀ 湘林8号×♂ 长林166号低8%，表明 湘林8号与 长林166号杂交亲和性较高；♀ 长林4号×♂ 长林3号3月份人工授粉座果率比♀ 长林4号×♂ 长林166号高4%，表明‘长林4号‘与‘长林3号’杂交亲和性较高；♀ 湘林8号×♂ 长林3号3月份人工授粉座果率比♀ 长林4号×♂ 长林3号低4%，表明 长林4号与 长林3号杂交亲和性较高；♀ 湘林8号×♂ 长林166号、♀ 长林4号×♂ 长林166号和♀ 岑软3号×♂ 长林166号3月份人工授粉座果率分别为48%、40%、42%，3个母本与‘长林166号’杂交亲和性大小为：‘湘林8号’＞ ‘岑软3号’＞ ‘长林4号’。 ‘长林166号’与‘岑软3号’的人工授粉正反交组合中，正交座果率均高于反交组合，表明正交杂交亲和性更好；正反交自然授粉在1月份和3月份的座果率均高于人工杂交座果率，♀ ‘岑软3号’×♂ ‘长林166号’杂交组合在1月和3月的座果率分别为96%和94%，表明 ‘岑软3号’作为母本，自然授粉良好，前期落果少。

3 结论与讨论

李春林等[15]对长林系列油茶活体授粉和离体培养下花粉管萌发进行了比较，表明活体萌发快于离体培养萌发，本试验对长林系列油茶进行了贮藏特性研究。本试验结果表明，‘长林3号’和‘长林166号’油茶无性系花粉在不同贮藏条件下，花粉生活力差异较大，随贮藏时间延长，花粉生活力呈明显下降趋势；室温干燥下贮藏花粉生活力下降最快，2个油茶无性系花粉贮藏50 d全部失活，低温干燥条件下贮藏的花粉生活力下降缓慢，冷冻干燥贮藏的下降速率最慢。许林等研究表明贮藏温度低有利于花粉生活力的保存，4℃和-20℃下茶树花粉可保存4个月以上，本试验的2个油茶无性系花粉在冷冻干燥贮藏90 d 后仍有生活力，与其研究结果基本一致[16]。杨志玲等研究发现红山茶组花粉冷冻密封贮藏（-18℃）1 a后花粉萌发率仍有34.83%[17]，而本试验研究发现‘长林3号’、‘长林166号’2种油茶花粉在冷冻干燥贮藏90d 后均有45%以上的萌发率，与其研究结果基本一致且同一贮藏条件下长林系列花粉更耐贮藏。黄永芳等研究表明‘岑软3号’油茶新鲜花粉的生活力为78.0%，其花粉贮藏特性规律表现为室内干燥贮藏下花粉生活力下降最快，低温干燥保存下花粉生活力下降速度慢于室内干燥保存下，冷冻干燥下花粉生活力下降速度最慢[18]，岑软3号油茶花粉贮藏特性与‘长林3号’、‘长林166号’相似。Diana等研究也表明冷冻干燥是保存花粉的良好方法之一[19]。袁德义等研究表明攸县油茶和黄蛋红花茶花粉在-20℃贮藏条件下生活力明显低于4℃、25℃和室温条件，本试验与其结果相差很大，可能是各自研究材料间特性不一以及各自试验条件有所差异[20]。‘长林3号’、‘长林166号’油茶无性系在同一贮藏时间及条件下花粉萌发率存在差异，表明不同品种的油茶花粉生活力存在差异[21]。花粉生活力主要与遗传物质相关，同时花粉营养物质有限，呼吸消耗会导致其生活力逐渐下降，因此贮藏时需要放入硅胶进行干燥保存，减缓呼吸作用[22-23]。

通过6种杂交组合的亲和力对比，发现亲和力较好的组合是♀ 湘林8号×♂长林3号、♀长林4号×♂长林3号、♀湘林8号× 长林166号♂。比较几种杂交组合，发现‘湘林8号’作为母本时座果率较高，可以作为杂交母本材料。♀岑软3号×♂长林166号3月份自然授粉座果率高达94%，显著高于杂交授粉座果率，可能是‘岑软3号’作为母本自然授粉良好特性有关，同时也可能是人工杂交操作不当导致杂交座果率过低，另外杂交时空气湿度也是影响因素之一。6个杂交组合3月份座果率相对1月份均有下降，可能是因为期间风雨天气导致油茶落果较严重。杂交座果率受多方面因素的影响，除了气候因素外，亲本间杂交不亲和性以及树体生长旺盛期过多消耗营养是因素之一[24]。此外，人为操作的不当、授粉期间降雨过多或气温低抑制花粉正常萌发伸长影响受孕等，都会导致油茶座果率下降[25]。

油茶生殖生长中存在自交不亲和性以及种间杂交不亲和性，进行花蕾期授粉是解决这一问题的重要手段[26-28]。本试验通过研究‘长林3号’、‘长林166号’油茶无性系花粉的贮藏特性以及6个杂交组合亲和性研究，分析了油茶无性系花粉贮藏最佳条件及其亲本间杂交亲和性，为油茶花粉保存提供方法和指导，为油茶远距离及花期不一杂交提供理论依据及品种的配置给予应用指导。

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The Research about the storage characteristic of pollen and artificial hybridization affinity about five kinds ofCamellia oleiferaclones

ZHA Qian-hui, TAN Sha, HUANG Yong-fang, HONG Wen-hong, YANG Ya-hui, GONG Li-hua
(a. College of Forestry and Landscape Architecture; b.Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China )

To investigate the storage characteristic of pollen and artificial hybridization affinity about five kinds ofCamellia oleifera. 5Camellia oleiferaspecies which consisted of ‘Changlin 3’, ‘Changlin 166’, ‘Changlin 4’, ‘Xianglin 8’ and ‘Cenruan 3’ were aimed to examine the effects of different storage condition on pollen germination and the artificial hybridization affinity. Through the contrast of pollen germination rate in different storage conditions and the statistics and analysis of hybrid fruit-set rate of different hybridized combinations, it indicated that the longer the storage time is, the lower the pollen viability will be. It also showed that the freeze-dried was the best storage method ofCamellia oleiferapollen. The pollen germination rates of ‘Changlin 3’ and ‘Changlin 166’,Camellia oleiferapollen were all more than 45% after 90 days’ freeze-dried storage and all the pollen lost viability after 50 days’ dry storage at room temperature. After 90 days of cold-dried storage, the pollen germination rate was about 10% less than in freeze-dried storage.Among the six hybridized combinations, there were four combinations with good affinity. They were ♀ Xianglin 8× ♂ Changlin 3, ♀Changlin 4× ♂ Changlin 3, ♀ Xianglin 8× ♂ Canglin 166, ♀ Changlin 166× ♂ Cenruan 3. And the fruit set percentages of the four combinations in March were 40%, 44%, 48%, 52% respectively.

pollen viability; pollen storage; fruit-set rate; artificial hybridization affinity

S727.3；S794.4

A

1673-923X(2015)10-0079-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.014

2014-02-10

广东省林业科技创新项目（2013KJCX009－05,2011KJCX014－01）

查钱慧，硕士研究生

黄永芳，教授；E-mail：hyfang@scau.edu.cn

查钱慧，谭 莎，黄永芳，等. 5个油茶无性系花粉贮藏特性及杂交亲和力的研究[J].中南林业科技大学学报，2015,35(10)： 79-82, 108.

[本文编校：吴 彬]