不同杉木人工林土壤线虫群落结构及多样性研究

李树战，王圣洁，刘君昂，吴 毅，何苑皞，李 河

（中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

不同杉木人工林土壤线虫群落结构及多样性研究

李树战，王圣洁，刘君昂，吴 毅，何苑皞，李 河

（中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

为了探讨土壤线虫在人工林生态系统中的功能及其对环境变化的响应。该研究利用18S rDNA的宏基因组比较了湖南省攸县不同发育阶段（3年、13年、26年）以及不同栽培代数（1代、2代、3代）杉木人工林的土壤线虫的群落结构及多样性。结果表明：(1)测序共获得了2 111条隶属于线虫动物门的序列。经聚类后产生了27个 OTUs。主要类群有Prismatolaimidae、Monhysteridae、Alaimidae、Qudsianematidae、Criconematidae、Plectidae 它们分别占总序列数的31%、15%、11%、8%、6%、5%，其中 Prismatolaimidae 在所有样地中均占绝对优势，Aphelenchidae、Cephalobidae、Criconematidae、Rhabdolaimidae、Tylenchidae这5个类群的相对丰度在各样地间具有显著性差异（p＜0.05）；(2) 冗余分析（RDA）发现所选的5块样地的线虫的群落结构有着明显的差异，FRC，SYC，TYC三块样地的群落结构较为相似。FYC与FRC之间差异性最大；(3) 6种不同的多样性指数的单因素方差分析发现，各样地的多样性指数之间没有达到显著性差异。说明长期种植单一杉木人工林能够改变土壤线虫的群落组成，但并没有改变种群的多样性。土壤线虫中存在种的冗余现象。

杉木人工林；线虫；宏基因组分析；群落结构；群落多样性

杉木Cunninghamia lanceolata是我国特有的速生用材树种之一。由于结构均匀，纹理通直，不翘不裂，生长快，分布广，单产高，运销范围广，销售数量大，古往今来，杉木一直是我国重要的栽培树种，在我国森林蓄积量与木材生产中占有重要的地位[1]。但因杉木人工林的纯林化以及多代连栽现象的加剧导致地力的衰退，同时还出现了生产力下降、水土流失增加、病虫害增加等现象，严重影响了杉木人工林的可持续经营[2]。

土壤作为森林生态系统的重要组成部分和物质基础，在维护森林健康、促进森林更新中发挥着重要的作用[3]。在陆地生态系统中,地上部分的生物与地下部分的生物在群落和生态系统水平上是相互作用的，并深刻影响着陆地生态系统的结构与功能。2004年，国际著名刊物Science发表了系列文章：Soils： The Final Frontier，以唤起各国政府及科学界对土壤生态学研究的重视[4]。

线虫（Nematode）是一类生活在土壤或腐烂的植被中的无脊椎动物，以有机质、微生物(如细菌)为食，在各类土壤中均非常丰富。它们在土壤生态系统腐屑食物网中占有重要的地位，是有机质的分解、植物营养的矿化及养分循环的基础，在土壤生态系统中发挥着重要的功能[5]。由于线虫具有分布广泛，生存和适应能力强，直接参与生态系统的物质循环和能量流动，占据土壤食物网的很多关键链接，对环境变化敏感，实验周期短等诸多优点[6-7]。美国学者Neher[8]指出线虫群落(Nematode community)可以作为土壤健康的指示生物。 自80 年代起，线虫开始被用于陆生群落环境变化的指示生物。90年代，线虫对陆地生态系统的环境指示作用引起越来越多的重视[9]。目前已成为生态学上指示生物的首选对象之一。

目前，土壤线虫研究多采用线虫形态鉴定法，而且形态鉴定法工作量大、费时费力、难以快速分析多个土壤样品的线虫群落特征，这使得土壤线虫研究在物种深度和样品广度方面存在缺陷[10]，限制了土壤线虫研究的发展。随着分子生物学的快速发展，分子生态技术被应用到土壤线虫研究中，为线虫分类鉴定和系统关系的分析提供了一个有效的工具。通过线虫基因序列的比对分析，可对线虫进行准确的分子鉴定和系统发育的研究，极大地提高了土壤线虫研究的精度和效率[11]。

该研究就是借助于第二代测序技术，以湖南黄丰桥不同发育阶段以及不同栽培代数的杉木人工林土壤宏基因组为研究对象。通过对宏基因组的比较分析，研究了不同杉木人工林土壤线虫群落结构与多样性的变化，对探明杉木人工林土壤生态系统过程机制和提高土壤健康质量将具有十分重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区地处罗霄山脉中段武功山西南，呈带状横跨于湖南省攸县东西部的国有黄丰桥林场，介于东经 113°04′～113°43′，北纬 26°43′～27°06′之间。以中低山地貌为主，最高海拔1 270 m，最低海拔115 m。年平均气温17.8℃，无霜期292 d，年均降雨量1 411 mm，年蒸发量1 261～1 388 mm，相对湿度70%～74%。亚热带季风湿润气候，土壤以板页岩发育而成的山地黄壤为主，红壤、紫色土与山地黄棕壤等也有分布。地带性植被为常绿阔叶林[12]。

1.2 样地设置

该研究在对国有黄丰桥林场全面调查的基础上，选择了5块不同发育阶段及不同栽培代数的杉木人工林作为研究样地（见表1）。并在每块样地中设置3块标准地，标准地大小为20 m × 30 m。

1.3 土壤样品的采集及处理

土壤样品于2013年4月采集。在每块标准地内分别设置5个样点，采集除去表层土后0～10 cm土层的土壤，每份土样过筛(＞4 mm)去除根及石块后，混合均匀放入封口袋。保存于干冰中带回实验室，存储于-80℃冰箱中待用。

1.4 土壤理化性质测定

土壤pH值测定采用直接测定法；含水量用烘干土法（105℃，8 h）；有机质采用水合热重铬酸钾—硫酸—比色法；全氮采用凯氏定氮法；速效氮采用碱解扩散法；速效磷采用盐酸-氟化铵法；速效钾采用火焰光度法[13]。

1.5 土壤宏基因组的提取及高通量测序

按照OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA试剂盒的说明书，对土壤样品的总DNA进行抽提。抽提后的总DNA通过1%琼脂糖凝胶电泳检验合格后。 以 3NDF(5-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3’)为正向引物，V4_euk_R2(5’- ACGGTATCT(AG)ATC(AG)TCTTCG-3’)为反向引物[14]。对 15个土样总DNA中的18S rDNA片段进行扩增。将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒(AXYGEN 公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCL洗脱；用QuantiFluor™ -ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)定量，之后进行乳液PCR采用的是：Roche GS FLX Titanium emPCR Kits，操作按说明进行。将乳液PCR富集的产物使用Sequencing Method Manual-XLR70 kit 进行测序前处理。再后采用Roche GS FLX测序系统进行高通量测序(由上海美吉生物医药科技有限公司完成)。

1.6 数据处理

1.6.1 测序数据的分析

对序列进行归类操作(cluster)，生成操作分类单元OTUs（Operational Taxonomic Units）该研究采用的是基于序列相似度的方法，以97%相似性为划分标准，借助UCHIME、Mothur等软件将序列分为不同的OTUs。提取每个OTU的代表序列并与SILVA数据库中信息进行比对。获得测序结果中的科、属等信息。

1.6.2 群落结构分析

利用Mothur提取各个OTU获得的DNA条数。并计算各个类群的相对丰度。用R软件ggplot2软件包绘制群落结构的Heatmap图。系统发育树采用MEGA 5.0软件构建。各样地的香浓指数（Shannon Diversity）、麦金图史指数（McIntosh's Index）、辛普森指数（Simpson's Index）、优势度指数（Dominance Index）、均匀度指数（Evenness Index）、伯杰·帕克指数（Berger-Parker Index）使用BIO-MAP软件计算得出。ANOVA分析使用SPSS19软件。RDA排序分析应用CANOCO 4.5软件完成。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

经过统计发现各样地土壤理化性质指标差异显著（见表2）。其中第二代杉木幼林（SYC）的PH值（4.29）、有机质（30.54 g/kg）、全氮（1.62 g/kg）都是最低的。第一代杉木成熟林（FRC）速效氮含量最高，为116.38 mg/kg。第一代杉木中龄林（FMC）速效钾含量最高，为96.62 mg/kg。第二代杉木幼林（SYC）速效磷含量最高，为1.85 mg/kg。

表2 样地土壤理化性质†Table 2 Physico-chemistry characteristics of the analyzed soil sample

2.2 测序数据的统计分析

经过454焦磷酸测序，共得了2 111条隶属于线虫动物门(Nematoda)的序列。采用Mothur 对得到的的序列进行了分类，产生了27个OTUs，提取每个OTU的代表序列，使用MEGA 5.0 构建系统发育树（见图1）获得OTUs相互间的遗传距离。并将这些代表序列与SILVA数据库中的参考序列进行比对，参考其的命名系统，获得每个OTU的分类信息。经统计，在获得的线虫动物门的序列中，主 要 类 群 有Prismatolaimidae、Monhysteridae、Alaimidae、Qudsianematidae、Criconematidae、Plectidae它们分别占总序列数的31%、15%、11%、8%、6%、5%（见图2）。

图1 各OTU代表序列的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree with representatives sequence of each OTU

2.3 不同杉木人工林土壤线虫群落组成及数量特征

在获得各个OTUs 的分类信息后，利用Mothur提取各OTU获得的DNA条数。并统计各个类群在不同类型杉木人工林中的相对丰度。

利用R软件的ggplot2软件包以各样地群落的相对丰度数据，绘制群落结构的Heatmap图（图3）。从图中可以看出不同类型的杉木人工林线虫的群落结构差别很大。Prismatolaimidae依然是所有样地中的优势类群。且在各样地间其相对丰度变化不明显。Aphelenchidae、Cephalobidae、Criconematidae、Rhabdolaimidae、Tylenchidae这五个类群的相对丰度在各样地间具有显著性差异（p＜0.05）。Aphelenchidae只在第1代杉木幼林中出现了。Rhabdolaimidae只在第1代杉木幼林和第1代杉木成林中出现。Tylenchidae 只在第1代杉木幼林和第3代杉木幼林中出现。Cephalobidae在第1代杉木中林中的相对丰度（0.77%）显著小于其他样地。而相反的，第2代杉木中林Criconematidae 的相对丰度（23.44%）却大大的高于其他样地。

图2 线虫分布比例图Fig.2 Pie chart of nematoda taxonomical distribution

2.4 不同杉木人工林土壤线虫群落的多样性分析

根据每个样地各群落的数据。借助BIO-MAP软件我们计算了各样地的香浓指数、麦金图史指数、辛普森指数、优势度指数、均匀度指数、伯杰·帕克指数。并进行了单因素方差分析，结果显示五种不同类型的杉木人工林的各种多样性指数之间并没有显著性差异。

表3 土壤线虫的分类信息及群落组成Table 3 The classification information and Composition of soil nematode communities

表4 土壤线虫群落多样性分析Table 4 Soil nematode community diversity analyse

2.5 土壤线虫群落分布与理化性质的冗余分析

冗余分析（RDA）是指采用二维排序图的形式展示群落结构与环境因素间的关系。其可以结合多个环境因子一起分析，并能够独立保持各个环境变量对生物变化的贡献率，其样方排序值既反映了物种组成及生态重要值对生物的作用，同时也反映了环境因子的影响[15]。我们采用这种方法，比较了不同杉木类型杉木人工林土壤线虫群落分布与理化性质间的关系（图4）。图中五种类型的样地间的距离代表其群

图3 线虫群落结构的Heatmap图Fig.3 Heatmap presentations of nematode community

图4 土壤线虫主要群落与环境解释变量的RDA排序图Fig.4 The ordination diagram of RDA with soil dominant nematode communities and explanatory variables

落的欧几里得距离，长度越短表示差异越小，反之越大。因此可以得知：FRC，SYC，TYC三块样地的群落结构较为相似。FYC与FRC之间距离最大，二者间的群落结构差异性明显。另外速效钾、速效氮、全氮以及含水量对土壤线虫的分布影响比较大。Chromadoridae、Dorylaimidae、Monhysteridae、Nygolaimidae、Plectidae、Rhabditidae这六种类群与pH值、速效磷、全氮、有机质之间有比较明显的正相关，Tripylidae、Tylenchidae与含水量之间有明显的正相关，却与速效钾之间是负相关的关系。Prismatolaimidae与速效氮之间也是负相关的关系。

3 结论与讨论

本研究采用454焦磷酸测序技术对湖南黄丰桥国有林场的不同发育阶段以及不同代际的杉木人工林土壤线虫的群落结构多样性进行了比较，得到以下结果：

试验选取的5块不同类型的杉木人工林共获得了2 111条隶属于线虫动物门的序列。经聚类后产生了27个OTUs。主要类群有Prismatolaimidae、Monhysteridae、Alaimidae、Qudsianematidae、Criconematidae、Plectidae它们分别占总序列数的31%、15%、11%、8%、6%、5%。其中Prismatolaimidae在所有样地中均占绝对优势。在第1代幼林中优势最为明显，相对丰度达到了38.07%。并且其在5块样地中的分布出现了一定的规律性，即在同一代的人工林中，Prismatolaimidae的相对丰度从幼龄林到成熟林。其变化趋势是先降低再升高。在同一林龄的人工林中，Prismatolaimidae的相对丰度从1代林到3代林。其变化趋势同样是先降低再升高。刘丽等[16]、焦如珍等[17]和盛炜彤等[18]分别报道了不同地区杉木人工林土壤微生物数量的变化, 他们发现随着杉木人工林林龄增长土壤中细菌和真菌的数量呈先下降后上升的趋势,并认为植被发育和植物多样性与土壤微生物种群及数量成正相关。同样的对于不同代数的杉木人工林。由于土壤退化第1代要比地代细菌和真菌的更为丰富，而第3代由于进行了一些人为的地力恢复措施。其细菌和真菌也较第2代高。根据A V Coomans[19]的描述，Prismatolaimidae是一类以细菌为食的线虫，由此说明Prismatolaimidae类线虫的变化是由于其食物来源的变化造成的。

从样品的的Heatmap图以及RDA分析中我们可以看出，所选的5块样地的线虫的群落结构有着明显的差异，但是从多样性的单因素方差分析发现，各样地的线虫多样性间并没有达到显著性差异。1992年，Walker[20]提出了“冗余种”假说。他认为一个生态系统中存在可以维持正常功能的最小物种数，生态系统的物种数目到一定程度后达到饱和,其他物种对生态系统的功能而言则是冗余的。强调某些物种的损失会因为其他物种丰富度的转变而得到补偿，而生态系统的功能不会受到影响。而我们的样地中，各物种的相对丰度有了很大的变化，但是多样性并没有大的变化。从而支持了Walker 的“冗余种”假说。

不同杉木类型杉木人工林土壤线虫群落分布与理化性质间的相关关系发现：速效钾、速效氮、全氮以及含水量对土壤线虫的分布影响比较大。Chromadoridae、Dorylaimidae、Monhysteridae、Nygolaimidae、Plectidae、Rhabditidae这六种类群与pH值、速效磷、全氮、有机质之间有比较明显的正相关，Tripylidae、Tylenchidae与含水量之间有明显的正相关，却与速效钾之间是负相关的关系。Prismatolaimidae与速效氮之间也是负相关的关系。说明杉木人工林能够通过改变土壤的理化性质来影响土壤线虫的群落分布。进而影响森林生态系统的养分循环。

[1]方 晰,田大伦,项文化.间伐对杉木人工林生态系统碳贮量及其空间分配格局的影响[J].中南林业科技大学学报,2010,30(11)： 47-52.

[2]李红军,周国英,吴 毅,等.杉木人工林化感作用研究综述[J].中南林业科技大学学报.2013,33(1)：31-34.

[3]张 华, 张甘霖.土壤质量指标和评价方法[J].土壤, 2001(6)： 326-330.

[4]邵元虎,声 雷.试论土壤线虫多样性在生态系统中的作用[J].生物多样性 ,2007, 15 (2)： 116-123.

[5]张 薇,宋玉芳,孙铁珩,等。土壤线虫对环境污染的指示作用[J].应用生态学报,2004, 15( 10)：1973- 1978.

[6]梁文举,葛亭魁,段玉玺.土壤健康及土壤动物生物指示的研究与应用[J].沈阳农业大学学报,2001,32(1)70-72.

[7]李玉娟,吴纪华,陈慧丽,等.线虫作为土壤健康指示生物的方法及应用[J].应用生态学报,2005, 16( 8)：1541～1546.

[8]Neher D A. Nematode communities： Indicators of soil health. In：Proceedings of the VII International Congress of Ecology,pp.308.Florence, Italy, 19-25 July 1998.

[9]Bongers T. 1990. The maturity index： An ecological measure of environmental disturbance based on nematode species composition.Oecologia, 83： 14～19

[10]Ettema C H,Yeates G W.Nested spatial biodiversity patterns of nematode genera in a New Zealand forest and pasture soil[J].Soil Biol Biochem,2003,35：339-342.

[11]田雪亮,刘起丽,郎剑锋.分子生态技术在土壤线虫多样性研究中的应用[J].广东农业科学, 2012,8：145-151.

[12]陈春林,周国英,闫法领,等.南方杉木人工林土壤健康评价研究[J].土壤通报.2012,43(6)：1318-1323.

[13]林先贵.土壤微生物研究原理与方法[M].北京： 高等教育出版社,2010.

[14]Jon Bra° te1, Ramiro Logares, Ce´dric Berney, et al.Freshwater Perkinsea and marine-freshwater colonizations revealed by pyrosequencing and phylogeny of environmental rDNA.The ISME Journal (2010) 4, 1144-1153.

[15]Ter Braak C J F. Canonical correspondence analysis： a new eigenvector method for multivariate direct gradient analysis[J].Ecology.1986,67： 1167-1179.

[16]刘 丽,段争虎,汪思龙,等.不同发育阶段杉木人工林对土壤微生物群落结构的影响[J].生态学杂志,2009, 28(12)：2417-2423.

[17]焦如珍,杨承栋. 杉木人工林不同发育阶段土壤微生物数量及其生物量的变化[J].林业科学,2005,41(6)：163--165.

[18]盛炜彤, 杨承栋, 范少辉. 杉木人工林的土壤性质变化[J].林业科学研究, 2003,16(4)： 377- 385.

[19]A V Coomans, D J Raski.Two new species of prismatolaimus de man, 1880 (nemata： prismatolaimidae) in southern chile.Journal of nematology, 1988, 20(2)： 288-303.

[20]Walker B H, Biodiversity and ecological redundancy[J].Conservation Biology, 1992.6 (1) ： 1823.

Research on soil nematode community Structure an diversity of difference Cunninghamia lanceolata plantations

LI Shu-zhan, WANG Sheng-jie, LIU Jun-ang, WU Yi, HE Yuan-hao, LI he
(Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees, Central South University of Forestry and Technology,Ministry of Education, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to study the function of soilnematodeand its responses to environmental changes, we used metagenome analyses of 18S rDNA gene region to identify differences in nematodecommunity structure and diversity among fifteen soil samples belonging to five differentCunninghamia lanceolateplantations. The plantations were located in Youxian County, Hunan Province in central China. The trees in these plantations were of different ages (3, 13, and 26 years) and belonged to different ecological successions(first, second, and third successions).We

a total of 2111 sequences which belonging to the phylum of nematode, Generated 27 OTUs after clustering.The dominant taxonomic groups across all samples werePrismatolaimidae、Monhysteridae、Alaimidae、Qudsianematidae、CriconematidaeandPlectidaewith each accounting for 31%、15%、11%、8%、6%、and 5%, and the group ofPrismatolaimidaewas dominant in all samples.The relative abundance of these five groups (Aphelenchidae、Cephalobidae、Criconematidae、RhabdolaimidaeandTylenchidae) have significant difference (p＜ 0.05) among the five plantations. The redundancy analysis (RDA) identified that the community structure of nematode among the five plantations were quite difference, and it was similar among the first successions with the age of 26 years、the second successions with the age of 3 years and the third successions with the age of 3 years. The largest difference occurs between the first successions with the age of 3 years and the first successions with the age of 26 years. The ANOVA analysis with 6 different diversity indices (Shannon Index、McIntosh’s Index、Simpson’s Index、Dominance Index、Evenness Index and Berger-Parker Index) show that there were no significant difference among different types ofCunninghamia lanceolataplantations.This study indicated that long term single with pure plantations could affect soilnematodecommunity, but it did not change the diversity of the population. There have species of redundancy in soil nematode.

Cunninghamia lanceolataPlantation; Nematode; Metagenome analyses; Community Structure; Diversity

S791.27

A

1673-923X(2015)10-0101-08

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.018

2014-03-04

国家林业公益性行业专项（101304402）

李树战，硕士，助教

刘君昂，教授，博导；E-mail：csuftsjw@163.com

李树战，王圣洁，刘君昂，等. 不同杉木人工林土壤线虫群落结构及多样性研究[J].中南林业科技大学学报，2015,35(10)： 101-108.

[本文编校：吴 彬]