响应面优化L－赖氨酸培养基

滕国生 刘 勇 武丽达 范春艳 王金枝 关 兵 史淑辉 佟 毅

（1.吉林中粮生化有限公司，吉林 长春 130012；2.玉米深加工国家工程研究中心，吉林 长春 130012；3.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春 130012）

赖氨酸是合成人和动物组织蛋白质的必需物质，是激素、体内酶、抗体等重要功能性物质的主要成分，人体和动物自身不能合成赖氨酸，必须从食物中摄取，而植物中含有的赖氨酸很少，被称为植物中第一限制性氨基酸［1，2］。国内外市场对赖氨酸的需求都非常大，主要用于饲料生产，约占90%左右，食品添加剂和强化剂占5%左右，还有5%用于医药中间体方面［3］。由25～30个赖氨酸残基聚合而成的ε－多聚赖氨酸是一种良好的食品防腐剂［4］。赖氨酸的市场需求迅速增长拉动了L－赖氨酸的生产，未来几年，中国食品工业赖氨酸的市场需求平均年增长将在10%左右［5］。随着用赖氨酸生产各种药物的需求量的增加，中国赖氨酸需求量目前估计在8万t/年左右［6］。赖氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、酶法、微生物发酵法［6］。微生物发酵产生的赖氨酸均为L－型，而生物所能利用的赖氨酸也为L－型。因此，微生物发酵法是目前工业生产L－赖氨酸最主要的方法［7］。

玉米浆为生产玉米淀粉的副产物，含有大量的糖类、多肽、生长素、可溶性蛋白质、游离氨基酸等其他有机物，是微生物发酵氨基酸的良好氮源［8－10］。玉米浆中很多成分是发酵生产氨基酸的前体成分，在氨基酸发酵中提供氮源和生长因子，玉米中的生物素、限制性氨基酸对多种氨基酸发酵的影响都很大［11］。玉米浆价格低廉，来源丰富，利用玉米浆发酵氨基酸有利于提高玉米浆的生物价值，降低工业生产氨基酸的成本。

响应面法是工艺优化常用的试验设计方法［12－14］。Plackett－Burman确定出主次因素。最陡爬坡法能够快速寻找各变量变化最优区域。这3种试验设计方法常用于微生物培养基的优化［15－18］。本试验拟运用 Design Experts 7.0分析软件，将Plackett－Burma（PB）方法和响应面法应用于L－赖氨酸发酵培养基成分的优化和发酵工艺关键参数的筛选，以期进一步提高L－赖氨酸产量，降低工业生产氨基酸的成本。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

L－赖氨酸棒杆菌株（代号：ATCC14067）：由吉林大学生命科学学院提供。

1.1.2 试验试剂

KH2PO4、MgSO4·7H2O、苏氨酸、CaCO3、NH4Cl、NaCl：分析纯，北京化工厂。

1.1.3 试验仪器

紫外分光光度计：UVMINI－1240型，日本岛津株式会社；

恒温摇床，SPX－150－Z型，中国上海跃进医疗器械厂。

1.1.4 培养基

种子培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆20g/L，KH2PO40.01%，MgSO4·7H2O 0.01%，CaCO34%，pH 7.0～7.2，0.75kg/cm2灭菌20min。

发酵培养基：葡萄糖40g/L，玉米浆40g/L，KH2PO40.02%，NH4Cl 6%，NaCl 1.8%，苏氨 酸 0.06%，CaCO36%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH 7.0～7.2，0.75kg/cm2灭菌20min。

1.2 培养方法

菌株经斜面活化后，取一环接入到含有40mL种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃中以200r/min震荡培养24h。取5mL培养后溶液接种到含有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于30℃以200r/min震荡培养48h。将发酵液于8 000r/min下离心10min，取上清液测定其中L－赖氨酸含量。每组相同发酵培养基平行试验3次，含量取平均值。

1.3 L－赖氨酸含量测定

采用茚三酮比色法［19］测定L－赖氨酸浓度，配制浓度为500μg/L的L－赖氨酸标准溶液，分别取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于干净的具塞比色管中，加水至1.0mL，再加入1.0mL茚三酮试剂，摇匀后塞紧管塞，沸水浴5min后冷却至室温，每管再加入50%乙醇8.0mL，于530nm处测定OD值。以L－赖氨酸含量为横坐标，OD值为纵坐标做标准曲线。得到线性回归方程为Y＝1.866x＋0.018（R2＝0.999 0）。以样品代替标准溶液，通过方程计算其L－赖氨酸含量。

1.4 试验设计

1.4.1 Plackett－Burman设计 本试验选取8种培养基成分，选用N＝8的Plackett－Burman设计。根据预试验，设定每个因素的高水平约为低水平的2倍，试验12次，响应值为L－赖氨酸含量。PB设计因素水平见表1。

表1 Plackett－Burman设计因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman design

1.4.2 最陡爬坡试验 根据PB设计的结果，由各因素效应值的大小确定变化的步长。正效应取高水平，负效应取低水平。按一定的梯度增加或者减少各因素的水平值，检测发酵液中L－赖氨酸含量的变化，含量最高组的水平值即为响应面分析的中心组。

1.4.3 响应面分析方法 根据PB设计筛选出的3个显著因素作为试验因素，根据最陡爬坡试验筛选出的浓度作为中心点，采用响应面中的Box－Behnken设计方法。

1.4.4 数据分析 采用Design Expert 7.0软件对数据进行回归分析，得最优组合。

2 结果与分析

2.1 Plackett－Burman设计结果与分析

采用Design Expert 7.0软件对表2进行分析，得到各影响因子的偏回归系数及其显著性结果，见表3。在8个因素中，C、E、H因素即 NaCl、MgSO4·7H2O、玉米浆对L－赖氨酸的得率影响显著（P＜0.05），故将 NaCl、MgSO4·7H2O、玉米浆确定为主要影响因素，且NaCl、MgSO4·7H2O为正效应，玉米浆为负效应。故在下一步试验中，应该在NaCl、MgSO4·7H2O的高水平基础上增加其含量，在玉米浆的低水平基础上减少其含量。对于影响不显著的因素，正效应因素与负效应因素分别取＋1水平和－1水平。

2.2 最陡爬坡试验结果与分析

根据PB试验结果中因素NaCl、MgSO4·7H2O、玉米浆效应的大小确定最陡爬坡试验变化的方向和步长。由表4可知，5组试验中，第4组的L－赖氨酸含量最高，故选择第4组的水平为下一步响应面设计的中心点，即NaCl 2.6%、MgSO4·7H2O 0.05%、玉米浆19.5%。

2.3 响应面设计结果与分析

Box－Behnken设计因素及水平取值见表5。

通过Design Expert 7.0软件对表6数据进行处理，得到回归方程为：

表2 Plackett－Burman试验设计及结果Table 2 The Plackett－Burman design and results

表3 Plackett－Burman设计各因素的偏回归系数及其显著性Table 3 Partial regression coefficients and significance of factors in Plackett－Burman design

表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Steepest ascent design and results

表5 Box－Behnken设计因素水平表Table 5 Factors and levels of Box－Behnken design

对此模型进行方差分析（表7）可知：拟合度R2＝0.973 7，说明该试验提取得率的试验值与预测值之间有很好的拟合度；P＜0.01说明该模型极其显著；失拟量为2.22说明失拟量相对于纯误差不显著；信噪比为12.603＞4表明该模型有足够的信噪比；该模型的F值为20.56，失拟项不显著。综上表明，该模型预测值与试验值的差异很小可用于指导试验。

在此模型中 A、B、AB、A2、B2均显著，C、AC、BC、C2不显著，同时各因素的均方值可以反映出各个因素对试验指标的重要性。均方值越大表明其对试验指标的影响越大。从表7的均方值可以看出影响赖氨酸得率因素的主次顺序为：A＞B＞C，即NaCl＞MgSO4·7H2O＞玉米浆。

表6 Box－Behnken设计及结果Table 6 The Box－Behnken design and results

表7 回归模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

表7 回归模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

“＊”表示差异显著，P＜0.05；“＊＊”表示差异极显著，P＜0.01；“—”表示不显著。

来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr＞F 显著性模型 640.80 9 71.20 20.56 0.002 0 17.32 5 3.46失拟项 13.32 3 4.44 2.22 0.325 2 —纯误差 3.99 2 2.00总误差＊＊A 101.75 1 101.75 29.38 0.002 9 ＊＊B 41.72 1 41.72 12.05 0.017 8 ＊C 9.03 1 9.03 2.61 0.167 3 —AB 26.94 1 26.94 7.78 0.038 5 ＊AC 2.67 1 2.67 0.77 0.419 8 —BC 1.73 1 1.73 0.50 0.511 4 —A2 392.35 1 392.35 113.29 0.000 1 ＊＊B2 90.96 1 90.96 26.26 0.003 7 ＊＊C2 4.72 1 4.72 1.36 0.295 6 —残差658.11 14

各因素交互作用对L－赖氨酸得率的相应曲面和等高线图见图1～3。由图1～3可知，NaCl与MgSO4·7H2O的交互作用显著。当玉米浆的含量一定时，随着培养基中NaCl和MgSO4·7H2O含量的增加，L－赖氨酸的得率先逐渐增加后逐渐降低，在 NaCl和 MgSO4·7H2O分别为2.66%，0.04%时达到最大值，此时L－赖氨酸得率为101.32g/L。当MgSO4·7H2O含量一定时，玉米浆与NaCl的交互作用并不显著；而当NaCl含量一定时，玉米浆与MgSO4·7H2O的交互作用也不显著。显示玉米浆的添加量对L－赖氨酸的得率影响不大，随着玉米浆含量的增加，L－赖氨酸的得率均略微有所增加，但增加的幅度都不大。

经过Design Experts 7.0软件的响应面优化设计，分析优化得到的最佳条件为 NaCl 2.72%，MgSO4·7H2O 0.05%，玉米浆21.13g/L，在此条件下，L－赖氨酸的理论得率为104.75g/L。通过对此最优模型进行3次验证，结果分别为104.52，104.97，104.60g/L，平均值为104.70g/L，与模型的理论值基本符合，说明该模型能够较好的预测实际发酵中L－赖氨酸的得率。

图1 NaCl与MgSO4·7H2O交互影响L－赖氨酸得率的响应面图和等高线图Figure 1 Response surface plot and contour plot of effect of sodium chloride and magnesium sulfate on L－lysine yield

图2 NaCl与玉米浆交互影响L－赖氨酸得率的响应面图和等高线图Figure 2 Response surface plot and contour plot of effect of sodium chloride and corn starch on L－lysine yield

图3 MgSO4·7H2O与玉米浆交互影响L－赖氨酸得率的响应面图和等高线图Figure 3 Response surface plot and contour plot of effect of magnesium sulfate and corn starch on L－lysine yield

3 结论

本试验运用Design Experts 7.0分析软件，先通过Plackett－Burman方法和响应面法确定了影响L－赖氨酸得率的主要因素为NaCl、MgSO4·7H2O和玉米浆，再通过爬坡试验和Box－Behnken设计方法，确定3个主要因素物质的添加量分别为2.72%，0.05%和21.13g/L，理论 L－赖氨酸得率为104.75g/L。经3次验证实验，平均值为104.60g/L，与理论值相符。此实际值与优化前的87.93g/L相比，提高了18.96%。因此，利用响应面分析方法优化L－赖氨酸棒杆菌株产L－赖氨酸的方法是可行的，同其它微生物发酵方法相比，此种方法降低了葡萄糖的含量，可以充分利用玉米浆所含营养物质，降低生产成本，更适宜工业生产。

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