苦荞壳总黄酮超声辅助醇提工艺的优化

杨 芳 杨万林 陈锦玉 邵金良 兰珊珊（云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650223）

苦荞麦为蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）双子叶植物，学名鞑靼荞麦（F.tataricum）［1］，主要分布在中国的西南山区［2］。它含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质及黄酮类物质等［3］。目前，荞麦加工中的主要原料是荞麦仁，而苦荞壳作为苦荞加工过程中的主要副产物，并未得到充分利用［4］。研究［5－7］表明，黄酮类化合物具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤和增强人体免疫力等多种生物活性。而苦荞壳富含黄酮类化合物且价格低廉，是潜在的黄酮类化合物的提取原料。

传统的荞麦黄酮的提取方法主要有：热水浸提法、碱水浸提法、乙醇回流提取法等，但是这些方法提取率低，提取时间较长［8］。新兴的方法主要有微波辅助提取法、亚临界提取法和超声波辅助提取法［9］。微波辅助提取法和亚临界提取法对设备要求较高，操作工艺条件需严格控制；而超声辅助提取法利用超声波在液体中的空化效应、热效应和机械作用，提高植物中有效成分的溶出速率，具有提取效率高、提取时间短的优点，且操作简单、成本低廉，更利于工业化生产。虽已有学者［10，11］采用超声波辅助提取法对荞麦籽粒、荞麦麸皮和荞麦壳中的荞麦黄酮提取工艺进行了研究，但因提取原料不同，提取工艺也有较大的差异。本试验拟以苦荞壳为原料，在单因素试验的基础上，采用响应面法对苦荞壳总黄酮的提取工艺进行优化，旨为苦荞壳总黄酮的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

云南苦荞壳：云南省昆明市寻甸县。荞麦壳在105℃下烘干至恒重，粉碎过60目筛，备用；

95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外分光光度计：UV－1800PC型，上海美谱达仪器有限公司；

超声波清洗机：KM－615D型，广州市科洁盟实验仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮得率的测定 参照文献［12］测定样品中的总黄酮含量，按式（1）计算总黄酮得率。

1.2.2 单因素试验 本试验以苦荞壳中总黄酮得率为指标，分别选取乙醇浓度、超声温度、超声时间和料液比4个因素作5个水平的单因素试验，每个试验重复3次。

（1）乙醇浓度：准确称取2.0g苦荞壳粉末，置于250mL的烧杯中。在超声温度60℃、超声时间30min、料液比1∶40（m∶V）的条件下，分别加入40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液进行超声提取。研究乙醇浓度对苦荞壳总黄酮得率的影响。

（2）超声温度：准确称取2.0g苦荞壳粉末，置于250mL的烧杯中。在乙醇浓度70%、超声时间30min、料液比1∶40（m∶V）的条件下，设定不同超声温度（40，50，60，70，80℃）进行超声提取。研究超声温度对苦荞壳总黄酮得率的影响。

（3）超声时间：准确称取2.0g苦荞壳粉末，置于250mL的烧杯中。在乙醇浓度70%、超声温度60℃、料液比1∶40（m∶V）的条件下，设定不同超声时间（10，20，30，40，50min）进行超声提取。研究超声时间对苦荞壳总黄酮得率的影响。

（4）料液比：准确称取2.0g苦荞壳粉末，置于250mL的烧杯中。在超声温度60℃、超声时间30min、乙醇浓度70%的条件下，设定不同料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，m∶V）进行超声提取。研究料液比对苦荞壳总黄酮得率的影响。

1.2.3 响应曲面优化试验 在单因素试验基础上，根据Box－Behnken试验设计原理，选择乙醇浓度、料液比、超声时间、温度进行四因素三水平的响应面分析，确定总黄酮最佳提取条件。

1.3 数据处理

采用Design－Expert 8统计软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对苦荞壳总黄酮得率的影响 由图1可知，乙醇浓度对苦荞壳总黄酮得率的影响较大。总黄酮得率先随乙醇浓度的升高而升高，当乙醇浓度为70%时达到最高值，随后呈下降趋势。随着乙醇浓度的逐渐升高，醇溶性物质的溶出率也随之增加，所以总黄酮得率先呈现升高的趋势；但是随着乙醇浓度的增加，苦荞壳中的一些醇溶性和脂溶性的杂质溶出量也逐渐增多，这些成分可能会与乙醇—水分子体系结合，与黄酮类化合物形成竞争，影响苦荞壳黄酮类物质的溶出，从而导致总黄酮得率下降。综合考虑试验结果、成本及后处理因素，乙醇溶液浓度控制在70%左右为宜。

图1 乙醇浓度对苦荞壳总黄酮得率的影响Figure 1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.1.2 超声温度对苦荞壳总黄酮得率的影响 由图2可知，温度对总黄酮得率影响较大。在提取温度低于60℃时，随着提取温度的上升，总黄酮得率也随之增加，高于60℃后，总黄酮得率急剧下降。这可能是由于随着温度的升高，总黄酮在乙醇溶液中的溶解度增加；同时由于温度升高，分子运动加快，扩散速率增加，促使提取速度加快［13］。但是当温度过高，黄酮类物质容易被氧化，分子结构遭到破坏。因此，提取过程中温度不宜过高，以60℃左右为宜。

图2 超声温度对苦荞壳总黄酮得率的影响Figure 2 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3 超声时间对苦荞壳总黄酮得率的影响 由图3可知，随着超声时间的延长，总黄酮得率逐渐增大，当超声时间为30min时达到最大值，随后总黄酮得率呈下降趋势。超声时间的延长可有效增加原料与提取液的接触时间，提高总黄酮的提取率；超声时间过长，醇溶性杂质的溶出量也会增加，对黄酮形成竞争性抑制，使总黄酮得率下降。因此，超声时间控制在30min左右为宜。

图3 超声时间对苦荞壳总黄酮得率的影响Figure 3 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.1.4 料液比对苦荞壳总黄酮得率的影响 由图4可知，总黄酮得率先随料液比的增大而增大，当料液比为1∶50（m∶V）时达到最大值，随后随着料液比的增加，总黄酮得率呈下降趋势。增大料液比，可使荞壳与溶剂的接触面积增大，有利于有效成分的溶出，提高提取率；但是随着料液比的增加，溶剂用量增多，达到提取完全所需时间会相应增长，同时浸出的黄酮对未浸出的黄酮有抑制浸提作用，使黄酮类物质的溶出速率减慢，从而影响总黄酮得率，且大量的溶剂会对后续的浓缩等操作带来不便。因此料液比控制在1∶50（m∶V）左右为宜。

图4 料液比对苦荞壳总黄酮得率的影响Figure 4 Effect of material－to－liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果及模型建立 根据单因素试验结果，选取乙醇浓度、料液比、超声时间和温度4个因素中较优的水平（表1），采用响应面试验优化超声辅助醇提法提取荞麦黄酮的最佳工艺条件，试验结果见表2。

表1 响应曲面优化试验因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

表2 苦荞壳总黄酮提取响应面分析方案及结果Table 2 Flavonoids from the analysis of programs and results by response surface

采用Design－Expert 8软件进行统计分析，得到荞麦总黄酮得率（Y）对乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度的二次多项回归方程：

由表3可知，试验中选用的模型P＜0.000 1，表明响应回归模型达到了极显著水平，具有统计学意义；相关系数R2＝0.989 2，表明该方程的拟合效果较好，可以用于不同条件下苦荞壳中总黄酮提取工艺的理论预测；失拟项P＝0.840 3，不显著，说明该方程对试验拟合较好。乙醇浓度和超声温度对总黄酮得率的影响极显著，超声时间和料液比对总黄酮得率的影响不显著；二次项对总黄酮得率均达到极显著水平；交互项CD对总黄酮得率的影响极显著，AD对总黄酮得率的影响显著，其余交互项均不显著。

2.2.2 响应曲面分析 图5直观地反映了乙醇浓度、料液比、超声时间、提取温度4个因素之间的交互作用对总黄酮得率的影响。响应面图中曲线走势越陡，表明该因素对总黄酮得率的影响越大；走势平滑，则影响较小。等高线图中椭圆形表示两因素交互作用对总黄酮得率影响显著，圆形则相反。由图5可知，乙醇浓度和温度、超声时间和温度的响应面图曲线坡度较陡，等高线图呈椭圆形，说明其交互作用对总黄酮得率影响显著；料液比和温度的交互作用对总黄酮得率的影响也较大，但是未达到显著水平（P值为0.119 2），这与方差分析结果相一致。当乙醇浓度为64%～74%，料液比为1∶44～1∶57（m∶V），提取时间为24～36min，温度为55～63℃时，总黄酮得率较高。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established regression model

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established regression model

R2＝0.989 2，Adeq Precision＝35.15＝0.978 3，＝0.958 2，CV＝1.26%；＊表示显著水平（P＜0.05），＊＊表示极显著水平（P＜0.01）

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1.93 14 0.14 91.31 ＜0.000 1 2.11E－02 14 1.51E－03失拟项 1.16E－02 10 1.16E－03 0.48 0.840 3纯误差 9.58E－03 4 2.40E－03总变异＊＊A 0.06 1 0.06 36.46 ＜0.000 1 ＊＊B 4.29E－03 1 4.29E－03 2.84 0.113 9 C 1.69E－04 1 1.69E－04 0.11 0.743 2 D 0.13 1 0.136 86.61 ＜0.000 1 ＊＊AB 6.00E－04 1 6.00E－04 0.40 0.538 6 AC 9.02E－05 1 9.02E－05 0.06 0.810 4 AD 8.74E－03 1 8.74E－03 5.79 0.030 5 ＊BC 2.26E－03 1 2.26E－03 1.49 0.241 8 BD 4.16E－03 1 4.16E－03 2.75 0.119 2 CD 1.55E－02 1 1.55E－02 10.26 0.006 4 ＊＊A2 0.65 1 0.65 427.76 ＜0.000 1 ＊＊B2 0.18 1 0.18 121.01 ＜0.000 1 ＊＊C2 0.25 1 0.25 166.43 ＜0.000 1 ＊＊D2 1.30 1 1.30 862.30 ＜0.000 1 ＊＊残差1.95 28

图5 各两因素交互作用对总黄酮得率影响Figure 5 Effects of pairwise interactions of the factors on the extraction rate of total flavonoids

通过Design－Expert 8软件进行统计分析，苦荞壳总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇浓度69.00%，料液比1∶50.71（m∶V），提取时间30.03min，提取温度58.86℃，总黄酮得率的预测值为3.568%。考虑实际操作，将试验条件修改为乙醇浓度69%，料液比1∶51（m∶V），提取时间30min，提取温度59℃。

2.3 苦荞壳总黄酮最佳提取条件验证实验

在乙醇浓度69%，料液比1∶51（m∶V），提取时间30min，提取温度59℃的条件下进行超声波辅助乙醇浸提苦荞壳总黄酮试验，平行验证3次，测得总黄酮的平均得率为3.542%，与预测值3.568%接近，偏差较小。结果表明该回归模型能较好地预测苦荞壳总黄酮得率，得到的最佳工艺条件比较可靠。

3 结论

本试验以单因素试验为基础，采用响应曲面试验优化超声辅助提取苦荞壳中总黄酮的工艺条件，得到超声辅助提取苦荞壳中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度69%，料液比1∶51（m∶V），提取时间30min，提取温度59℃，在该工艺条件下总黄酮的实际得率为3.542%。通过与王廷璞等［14］报道的采用浸提法提取苦荞壳中总黄酮的工艺相比，该工艺条件缩短了提取时间，显著提高了总黄酮得率。本研究得到的最佳工艺条件可为工业提取荞麦黄酮提供参考，为充分开发利用苦荞壳中黄酮提供依据。

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