双孢蘑菇抗氧化肽的没食子酸化修饰及其体外抗氧化活性

张 强 吴彩娥 祝嫦巍 訾士波 王 呈（.安徽科技学院生命科学学院，安徽 蚌埠 3300；.南京林业大学轻工科学与工程学院，江苏 南京 0037）

近年来，有关抗氧化肽的研究引起了人们的高度关注，相关的研究主要集中在制备工艺的优化、分离纯化与结构表征以及抗氧化功能研究等方面［1］。酶法制备的抗氧化肽，由于受原料蛋白一级结构的限制，其抗氧化活性远不如人工合成的抗氧化剂。因此，有必要对其进行适当的修饰以提高其生物学效用。美拉德反应［2］、类蛋白 反应［3］、自由 基降解［4］及高压脉冲电场处理［5］等方法已用于抗氧化肽的结构修饰，均取得了较理想的效果，但将没食子酸（GA）用于抗氧化肽结构修饰的相关研究国内外尚未见报道。没食子酸，又名五倍子酸、棓酸，化学名3，4，5－三羟基苯甲酸，广泛存在于自然界，是一类分子中具有羧基和羟基的天然多酚类物质［6］，药理学研究［7］表明，GA具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗基因突变、抗肿瘤等多种功效，而且对正常细胞没有毒副作用。GA作为一种抗氧化剂在食品、药品和化妆品中已有广泛应用［8］。另一方面，在一定的条件下，GA分子结构中的羧基可以和蛋白质或肽分子中的羟基或氨基基团发生亲核反应，其产物有望改善原食品蛋白质或肽的功能特性，甚至可以赋予原蛋白质或肽没有的新功能［9］。本研究针对酶法制备的抗氧化肽生物学效用较低的问题，拟将双孢蘑菇抗氧化肽（ABAP）与GA结合，对GA—ABAP的制备工艺进行探究，旨为活性肽类天然抗氧化剂的深入研究和开发提供一定的理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

双孢蘑菇抗氧化肽：本实验室自制；

1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）：美国Sigma公司；

菲洛嗪（Ferrozine）：美国Fluka公司；

铁氰化钾、氯化亚铁、三氯乙酸等：分析纯，市售。

1.1.2 试验仪器

微波炉：MZ－2070EGZ型，青岛海尔微波制品有限公司；

紫外可见分光光度计：TU－1810型，北京普析通仪器有限公司；

低温冷冻离心机：Eppendorf 5804R型，德国Eppendorf公司；

红外光谱仪：NICOLET 380型，美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 GA—ABAP制备的单因素试验

（1）加热时间对GA—ABAP制备的影响：按体积比5∶1量取5mg/mL的GA和5mg/mL的ABAP，混于具塞试管中，用1mol/L的HCl和NaOH调整溶液的pH至11.0，反应体系的总体积为10mL，将试管置于微波炉中加热（先700W，沸腾后改为140W）一定时间（3，4，5，6，7，8min）后，立即于冰浴中冷却，再用截留分子量300Da的透析袋透析48h，收集透析液，冻干，检测产物的还原力。

（2）体积比对GA—ABAP制备的影响：按不同的体积比（1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1）量取5mg/mL的GA和5mg/mL的ABAP，混于具塞试管中，用1mol/L的HCl和NaOH调整溶液的pH至11.0，反应体系的总体积为10mL，将试管置于微波炉中加热（先700W，沸腾后改为140W）6min，然后立即于冰浴中冷却，再用截留分子量300Da的透析袋透析48h，收集透析液，冻干，检测产物的还原力。

（3）pH对GA—ABAP制备的影响：按体积比4∶1量取5mg/mL的GA和5mg/mL的ABAP，混于具塞试管中，用1mol/L的 HCl和 NaOH 调整溶液的pH（9.0，10.0，11.0，12.0，13.0），反应体系的总体积为10mL，将试管置于微波炉中加热（先700W，沸腾后改为140W）6min，然后立即于冰浴中冷却，再用截留分子量300Da的透析袋透析48h，收集透析液，冻干，检测产物的还原力。

1.2.2 GA—ABAP制备的正交试验 综合单因素试验结果，根据L9（33）正交表进行正交试验，以还原力为考察指标，对GA—ABAP的制备工艺进行优化。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 ABAP结构变化的表征

（1）紫外—可见光谱分析：取适量的 ABAP、GA和GA—ABAP分别溶解于蒸馏水中，在190～700nm波长下进行扫描，记录吸收峰的波长和强度，并绘制扫描图谱。

（2）红外光谱分析：将完全干燥的 ABAP和GA—ABAP分别与干燥的溴化钾粉末混合，在玛瑙研钵中研细均匀，置于模具中压片，用傅立叶变换红外光谱仪于400～4 000cm－1进行扫描，检测红外吸收特征。

1.3.2 ABAP及GA—ABAP抗氧化活性测定

（1）还原力的测定：采用普鲁士蓝法［10，11］。吸光度值越大，还原力越强；

（2）对Fe2＋螯合能力的测定：采用菲洛嗪比色法［12］，按式（1）计算Fe2＋螯合率；

（3）清除超氧阴离子自由基能力的测定：采用硝基氯化四氮唑蓝（NBT）光还原法［13］，按式（1）计算超氧阴离子自由基清除率；

（4）清除DPPH自由基能力测定：采用直接比色法［14］，按式（1）计算DPPH自由基清除率。

式中：

R——螯合率（清除率），%；

A0——对照管的吸光度；

A——样品管的吸光度。

1.4 数据分析

每个试验重复测定3次，以平均值±标准差表示；数据采用DPS 7.05软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 GA—ABAP制备的单因素试验结果与分析

2.1.1 加热时间对GA—ABAP制备的影响 由图1可知，随着微波加热时间的延长，修饰产物的还原力逐渐增加，当反应7min后，再延长反应时间，修饰产物的还原力变化不大，表明反应基本达到平衡，因此，选择6～8min作为考察范围。

图1 加热时间对GA—ABAP制备的影响Figure 1 Effect of heating time on GA—ABAP preparation

2.1.2 体积比对GA—ABAP制备的影响 体积比会影响GA与ABAP之间的有效碰撞从而影响修饰反应。由图2可知，随着GA在反应体系中所占比例的增加，修饰产物的还原力总体呈上升趋势，当GA与ABAP的体积比为4∶1时，产物的还原力达到最大，再增大GA所占比例，产物还原力略有下降，可能是由于ABAP逐渐为GA所饱和的原因，因此选择体积比3∶1～5∶1作为考察范围。

图2 体积比对GA—ABAP制备的影响Figure 2 Effect of volume proportion of GA to ABAP on GA—ABAP preparation

图3 pH对GA—ABAP制备的影响Figure 3 Effect of pH on GA—ABAP preparation

2.1.3 pH对GA—ABAP制备的影响 pH会影响ABAP和GA上各种极性基团的解离，从而会影响修饰反应。由图3可知，修饰产物的还原力随pH的增加呈现先升后降的趋势，pH 10.0时修饰产物的还原力最大，可能是由于pH过高或过低时，ABAP和GA分子上各基团的解离状态不利于反应的发生，因此选择pH 9.0～11.0作为考察范围。

2.2 GA—ABAP制备的正交试验

根据单因素试验结果，以体积比、pH、加热时间为因素，进行L9（33）正交试验，正交试验设计见表1，正交试验极差分析及方差分析结果分别见表2、3。

表1 正交试验的因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment

由表2可知，影响GA—ABAP制备的各因素的排列顺序为A＞B＞C，即体积比＞pH＞加热时间。由表2的K值可以看出，随着体积比、pH或反应时间的增加，产物的还原力均呈增大的趋势，但是，如果继续增大体积比将会延长透析时间，并会造成GA的浪费；再增大pH使得反应条件不够温和；此外，反应时间对修饰反应的影响并不显著（见表3），结合极差分析的结果，并考虑到生产实际，最终确定GA—ABAP制备的最佳工艺条件为A1B3C3，即GA与ABAP的体积比5∶1，pH 11.0，微波加热时间8min。此外，本研究中，因素C的R值略低于空列组，可能是由于试验设计中对影响修饰反应的因素考虑不够全面，也或是因素C的水平步长设定太小，课题组后期将在此基础上作进一步研究。

表2 正交试验的极差分析表Table 2 Analysis of range table of orthogonal experiment

表3 正交试验的方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment

表3 正交试验的方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment

＊＊表示影响极显著（P＜0.01）。

因素 平方和 自由度 均方 F值 P值体积比 0.373 2 0.186 22.254 4 0.000 1＊＊ pH 0.155 2 0.077 9.243 3 0.001 4＊＊时间 0.033 2 0.017 1.976 9 0.164 7误差e 0.049 7 2 0.024 8

2.3 ABAP结构变化的表征

2.3.1 紫外—可见光谱分析 GA、ABAP及按优化条件制备所得GA—ABAP的紫外—可见光谱见图4。ABAP在220nm有一个非常明显吸收峰，GA在216，260nm处各有一个较强吸收峰，GA—ABAP的最大吸收峰位于209nm，相对于原ABAP的220nm发生了明显的蓝移，表明ABAP与GA之间的确发生了修饰反应，生成了一个新的产物。

图4 GA、ABAP及GA—ABAP的紫外—可见光谱Figure 4 UV－Visible spectra of GA，ABAP and GA—ABAP

2.3.2 红外光谱分析 由图5可知，ABAP的—NH2吸收峰在3 436.70cm－1，GA—ABAP的—NH2吸收峰在3 425.13cm－1；ABAP的—COOH 吸 收 峰 在1 402.07cm－1，GA—ABAP 的—COOH吸收峰在1 411.71cm－1；ABAP的C—O吸收峰在1 643.14cm－1，GA—ABAP的C—O吸收峰在1 648.92cm－1，相对于ABAP，GA—ABAP的这4个吸收峰发生了明显的位移。特别是GA—ABAP在1 533.21cm－1左右出现了一个新吸收峰，归属酰胺 N—H的弯曲振动［15，16］，在871.71cm－1处出现另外一个新吸收峰，归属苯环C—H面外的弯曲振动［17］，这表明GA与ABAP不是机械混合，而是发生了化学反应。

2.4 ABAP及其GA—ABAP的体外抗氧化活性

图5 ABAP及GA—ABAP的红外图谱Figure 5 Infrared spectrum of ABAP and GA—ABAP

ABAP及GA—ABAP（浓度均为0.3mg/mL）的体外抗氧化活性见图6。由图6（a）可知，GA—ABAP的还原力显著高于 ABAP（P＜0.01），大约是 ABAP的11.16倍，且优于同浓度的2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（BHT），但不及同浓度的抗坏血酸（Vc）；由图6（b）可知，GA—ABAP对于Fe2＋的螯合能力优于 ABAP（P＜0.01），比 ABAP提高了78.00%，但仍低于同浓度的Vc和乙二胺四乙酸（EDTA）；由图6（c）可知，GA—ABAP对超氧阴离子自由基的清除能力较ABAP提高了109.80%（P＜0.01），几乎与 Vc相当，并优于同浓度的BHT（P＜0.01）；由图6（d）可知，GA—ABAP对DPPH自由基的清除能力与Vc相当，并显著高于BHT及ABAP（P＜0.01），大约是 ABAP的9.83倍。

图6 ABAP及GA—ABAP的体外抗氧化活性Figure 6 In vitro antioxidant activities of ABAP and GA—ABAP

3 结论

ABAP的最佳修饰工艺为：GA与ABAP的体积比5∶1，pH 11.0，微波加热时间8min；修饰后的ABAP抗氧化活性显著提高，还原力和对DPPH自由基的清除能力分别为修饰前的11.16和9.83倍，对Fe2＋的螯合能力和对超氧阴离子自由基的清除能力分别比修饰前提高了78.00%和109.80%。

本研究采用的修饰方法具有时间短、成本低、修饰效果好等特点，可为其他抗氧化肽类天然抗氧化剂的研究开发提供参考，但研究过程中并未考虑样品浓度及微波功率对修饰反应的影响，且仅研究了修饰物的体外抗氧化活性。因此，下一步将在本研究基础上增加考察因素，结合响应面法进一步优化修饰工艺，同时开展修饰物的体内生物学效用研究。

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