产CLA乳酸菌体内、体外抑菌活性的研究

陈　佳，许　晖

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030）

产CLA乳酸菌体内、体外抑菌活性的研究

陈佳，许晖

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030）

采用体内和体外抑菌法研究产CLA乳酸菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌作用。体外抑菌实验表明，乳酸菌发酵上清液对大肠杆菌的抑制作用最强，对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用相对较弱。体外研究还发现，乳酸菌发酵液在pH＜5.0时，抑菌效果较好，并且具一定的热稳定性，对过氧化氢酶和蛋白酶的抗性较高。体内抑菌实验表明，该乳酸菌能够有效降低以上三种致病菌引起的小鼠死亡率，且体内抑菌效果随剂量的增加而增强。结论：产CLA乳酸菌在体内和体外均有较好的抑菌效果。

CLA，乳酸菌，抑菌作用，体内，体外

乳酸菌是被FDA认定的食品级安全微生物[1]，并且是我国允许添加到食品中的益生菌之一（如乳酸菌饮料、发酵肉制品等）。乳酸菌具多种活性功能，在医学临床上，通常使用乳酸菌制剂来调节肠道功能紊乱（如大肠炎症等）以及改善机体营养状况等[2]。许多研究报道表明，乳酸菌在发酵的过程中，除了能产生乳酸等活性物质以外，还能够产生亚油酸异构酶，此酶能够将亚油酸异构化为共轭亚油酸[3]，如费氏丙酸杆菌嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）及植物乳杆菌等[4-7]。共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是一种具有抗癌、调节免疫、脂质代谢和抑菌等多种生理活性的天然脂肪酸功能因子[8-9]。天然CLA食用安全、无毒[10]，主要来源为动物性食品（如肉、乳制品等），植物性食品中含量较低[11-13]。但目前人们通过食用天然食品所获得CLA的量远低于营养推荐量（15～10mg/kg体重），所以在日常饮食中适当补充CLA是必需的。由于乳酸菌兼性厌氧，能够大规模的发酵生产，并且发酵条件可控制，因此可以作为CLA功能性食品开发的一种原菌种，应用于食品工业。本实验室从玉米青贮中分离筛选出一株高产CLA乳酸菌—植物乳杆菌ANCLA01，通过研究此菌在体内、体外抑菌效果，明确其抑菌特性，为产CLA乳酸菌将来在功能性食品工业中的开发应用提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

植物乳杆菌ANCLA01来自于玉米青贮，由本实验室分离筛选（中国国家微生物保藏中心保藏，保藏号：CGMCC No.1906）；大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌中国兽药监察所；过氧化氢酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶，乳酸苏州奥维科生物科技有限公司；共轭亚油酸纯品Sigma公司；乳酸杆菌培养基、麦康凯培养基、指示菌种所用培养基为营养琼脂北京市微生物制品厂；改良MRS液体培养基（pH6.5）。

电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司；手提式高压蒸汽灭菌锅上海云泰仪器仪表有限公司；Centrifuge 5417高速冷冻离心机美国BECKMAN COULTER。

1.2实验方法

1.2.1体外抑菌实验

1.2.1.1菌液、菌体的制备

乳酸菌菌液的制备：将植物乳杆菌ANCLA01接到MRS液体培养基中，活化后传代，再接种到MRS液体培养基中，37℃振荡培养48h；取发酵液于4℃，1000r/min，离心20min，取上清液备用。

指示菌菌液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌接种于普通营养琼脂斜面，37℃培养24h，加无菌水5mL，刮下菌苔制成细菌悬液，计数后，依次稀释浓度为10-2～10-9的悬菌液待用。

乳酸菌菌体的制备：将上步离心后的沉淀用生理盐水洗涤3次后，再稀释至原菌液浓度。

指示菌的培养：将指示菌分别接种于营养琼脂培养基，37℃振荡培养12h。

1.2.1.2排除乳酸对乳酸菌的抑菌作用的影响用乳酸调节与上清液相同pH的MRS液体培养基作为对照，乳酸菌上清液及菌体用相同体积的无菌水稀释，用于抑菌实验。

1.2.1.3热处理对抑菌作用的影响将乳酸菌发酵上清液在50、60、80、90℃水浴60min后，用于抑菌实验。

1.2.1.4pH对抑菌作用的影响将乳酸菌发酵上清液用高浓度的NaOH、HCI分别调pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0用于抑菌实验。

1.2.1.5乳酸菌发酵上清液酶处理后的抑菌效果乳酸菌发酵上清液分别用过氧化氢酶（0.5mg/mL）、蛋白酶K（1.0mg/mL）、胃蛋白酶（1.0mg/mL）、胰蛋白酶（1mg/mL）在37℃孵育1h后，进行抑菌实验。

1.2.2体内抗菌实验预实验将不同浓度的大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌悬菌液按0.5mL/10g体重的剂量，分别注射于小鼠腹腔，每浓度组为8～10只，体重为18～22g，观察小鼠4d内死亡情况。选定致死率为50%的菌液浓度为实验浓度。

1.2.3体内抗菌实验将生长良好的CLA乳酸菌制成细胞浓度为1.5×1011、2.0×1011、3.0×1011cfu/mL三个浓度的悬菌液备用。按体重相似原则，将小鼠随机分为12组，每组20只，分别为空白对照组、低、中、高浓度各三组，每天用上述剂量的乳酸菌悬菌液对小鼠进行灌胃，灌胃量为0.5mL/10g体重，对照组灌胃相同体积生理盐水。灌胃7d后，以预实验所得的50%致死率浓度的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌悬菌液给各组小鼠腹腔注射造成感染，注射后1、12h和24h时，对实验组小鼠再灌胃乳酸菌悬菌液，空白对照组灌胃相同体积生理盐水，观察小鼠精神状况及统计4d内各组动物死亡率。

1.2.4CLA的检测

1.2.4.1CLA标准曲线采用紫外吸光度检测法，以正己烷作为参比，将纯品CLA配制成不同浓度梯度，在234nm处测定吸收值，确定CLA含量并绘制标准曲线。

1.2.4.2小鼠肠道食糜CLA的检测统计小鼠存活率后，将存活的小鼠全部致死，无菌操作台取肠道食糜1g，加无菌水和正己烷各5mL，振荡萃取后，4℃，12000r/min，离心5min，破除乳化层，取正己烷相，用氮气吹干，得到脂肪酸酸提取物，再溶于5mL正己烷后，进行CLA的测定。

1.3统计分析

采用SAS 6.0软件对实验数据进行ANOVA方差分析，并进行LSD多重比较。

2　结果与讨论

2.1产CLA乳酸菌的体外抑菌作用的研究

2.1.1排除乳酸对乳酸菌的抑菌作用的影响对乳酸菌菌体、乳酸发酵上清液及对照液分别做了抑菌圈实验，结果见表1，与相同pH的对照培养液相比，乳酸菌上清液的抑菌圈直径比对照培养液大42.6%，差异极显著（p＜0.01），而上清液的抑菌圈直径比菌体的大76.5%，差异极显著（p＜0.01）。此结果说明在体外乳酸菌菌体的抑菌作用很弱，大量的抑菌活性物质存在于发酵上清液中，即乳酸菌的代谢产物抑菌活性较强。

表1　乳酸菌菌体及排除乳酸对乳酸菌抑菌效果的影响（mm）Table.1　Effect of Lactobacillus cell and removed lactic acid onCLA-producing Lactobacillus（mm）

表2　热处理对产CLA乳酸菌抑菌作用的影响（mm）Table.2　Effect of heat treatment on CLA-producing Lactobacillus（mm）

2.1.2热处理对乳酸菌抑菌作用的影响从表2可以看出，乳酸菌发酵上清液对三种指示菌均有较强的抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制作用最强（p＜0.01），与王菲、李南薇等[14-15]对乳酸菌抑制大肠杆菌作用的研究结果较一致。将发酵上清液在不同温度下处理，当温度达90℃时，发酵液对上述三种菌的抑菌活性尽管较对照组显著下降（p＜0.05）但仍有抑菌活性。在50℃时，乳酸菌上清液对大肠杆菌的抑菌作用相对对照组下降了近44.4%，差异极显著（p＜0.01）；当处理温度从50～90℃时，尽管发酵液抑菌作用缓慢下降，但是抑菌圈直径大小差异不显著（p＞0.05），说明该株植物乳酸菌在发酵过程中产生的抑菌活性物质当中，有一部分具有一定的耐热性。与郭颖等[16]对植物乳酸杆菌抑菌物质耐热性特性研究结果较一致。

2.1.3pH对产CLA乳酸菌抑菌作用的影响从表3看出，乳酸菌发酵上清液pH为2.0时，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有较高的抑菌活性。随着pH的升高，抑菌活性均呈下降趋势，由于指示菌不同，各组发酵上清液抑菌活性下降程度略有不同；当发酵上清液pH为5.0时，对三种菌都表现出较低的抑菌活性，并且差异极显著（p＜0.01），pH为6.0时，对三种菌均失去于抑菌活性。说明酸度对乳酸菌的抑菌活性影响较大，可能是因为在较低的pH下，大量的酸性物质抑制了细菌的生长繁殖，同时酸性物质又能与乳酸菌产生的细菌素和其他的抑菌活性物质协同作用，因此发酵上清液的抑菌效果较好。该结果与熊骏等[17]研究结果一致。

表3　pH对产CLA乳酸菌抑菌作用的影响（mm）Table.3　Effect of pH on CLA-producing Lactobacillus（mm）

2.1.4乳酸菌发酵上清液经酶处理后的抑菌效果从表4可以看出乳酸杆菌代谢产物经过过氧化氢酶、蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶处理后对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性几乎没有变化，三种指示菌的抑菌圈直径差异不显著（p＞0.05），说明该乳酸菌的代谢产物有较好的抗蛋白酶和抗过氧化氢酶的活性。

表4　酶处理对产CLA乳酸菌发酵上清液抑菌作用的影响（mm）Table.4　Effect of enzyme on CLA-producing Lactobacillus fermented supernatant（mm）

2.2产CLA乳酸菌的体内抑菌活性的研究

通过预实验对小鼠注射不同浓度的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌悬菌液，确定了其50%致死率浓度分别为8.0×107、4.2×1011、7.0×107cfu/mL，此浓度为正式实验注射浓度。注射后，观察结果如表5。

表5　各小组注射致病菌后小鼠存活情况的比较Table.5　Effect of different does of CLA-producing Lactobacillus on survival in mice

图1　CLA紫外吸收标准曲线Fig.1　Standard curve of ultraviolet absorption of CLA

图2　产CLA乳酸菌对小鼠食糜CLA产量的影响Fig.2　Effect of CLA-producing Lactobacillus cultures on CLA in mice’s chyme

由表5可见，产CLA乳酸菌培养物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌这三种致病菌引起的小鼠死亡率均有降低作用，并且随着乳酸菌的剂量增加，体内抑菌效果增强，小鼠死亡率极显著的下降（p＜0.01）。从图2看出，随着灌服乳酸菌剂量的增大，小鼠肠道内CLA产量上升，说明此菌株在肠道内产CLA活性较高，其原因可能是在体内产生的CLA能够协同其他抑菌活性物质共同作用，增强体内抗菌作用，提高小鼠免疫力，降低死亡率。实验期内观察小鼠精神状态，发现存活小鼠精神良好，无萎靡抑郁症状，采食正常。

3　结论

本实验发现产CLA乳酸杆菌发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌都有较强的抑菌活性。在体外，菌株产生的代谢产物在较低pH下，具有很强的抑菌活性，但是单独的乳酸杆菌菌体却没有很强的抑菌活性，说明在乳酸杆菌抑菌中起主要作用的成分存在于其代谢产物中，而菌体的抑菌活性可能只有在体内有可能表现出来，因为它可与其他致病菌竞争消化道粘附位点，通过竞争营养而抑制病原菌的生长[18]。CLA除了具有改善脂肪代谢，抗癌、抑癌等一些生理活性功能外，一些动物实验研究证明了：CLA在体内可以增加溶菌酶活性，提高体内抗体水平，增强机体的免疫力[19-20]。本实验中乳酸菌产生的CLA与乳酸菌本身产生协同作用，共同增强了体内的抑菌效果，显著提高小鼠的存活率。所以本文研究表明了产CLA乳酸杆菌在体内和体外均具有较开发应用提供了一定的理论基础。

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Study on antibacterial activity of conjugated linoleic acid producing Lactobacillus in vivo and vitro

CHEN Jia，XU Hui
（Department of Food and Bioengineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China）

To evaluate and compare the antibacterial activity of conjugated linoleic acid producing Lactobacillus（CLA-producing Lactobacillus）to E.coli，Staphylococcus aureus and Salmonella in vivo and vitro.In vitro test results showed：the antibacterial activity of LAB against E.coli was better than Staphylococcus aureus and Salmonella.The Lactobacillus showed high temperature stability up to 90℃，stability in the rage of pH2.0～5.0 and anti-protease activity and anti-catalyase activity.In vivo，the Lactobacillus had more powerful bacteriostatic effect and enhanced bacteriostatic effect to be with increasing does.Conclusions：The CLA-producing Lactobacillus was proved to be of bacteriostatic actions in vitro and in vivo．

conjugated linoleic acid；Lactobacillus；antibacterial activity；in vivo；in vitro

TS201.3

A

1002-0306（2015）04-0167-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.028

2014－05－08

陈佳（1982-），女，博士，讲师，研究方向：食品营养与生物技术。

安徽高校省级自然科学研究重大项目（KJ2012ZD10）；校级科研启动项目（2014ZR02zd）；省级社科规划项目（AHSK11-12D199）。