血流动力学变化对大鼠静脉重建影响模型建立及微观结构观察

郭占芳，梁向党，孙 赓，邹秀强，余宽宽，房卓群

血流动力学变化对大鼠静脉重建影响模型建立及微观结构观察

郭占芳，梁向党，孙 赓，邹秀强，余宽宽，房卓群

目的：观察血流动力学变化对大鼠颈动静脉内瘘后血管重建的影响。方法：取30只雄性SD大鼠，体质量300～350 g，行颈总动脉、颈外静脉造瘘术，以动静脉吻合口为中心、由静脉端1 cm进行取材作为实验组，对侧正常静脉1 cm处进行取材作为对照组，分别于术后1、2和4周观察颈动静脉重建微观结构变化情况。移植段血管纵行切开后，（1）行大体观察；（2）行HE染色，测量血管内膜厚度；（3）行EVG（Verhoeff's Van Gieson）染色，观察胶原纤维、弹性纤维变化；（4）行增殖细胞核抗原免疫组化，观察细胞增生情况。结果：超声扫描和大体观察结果显示，实验组和对照组血管均通畅。术后2和4周苏木精-伊红染色（hematoxyin-eosin staining，HE）结果显示，实验组血管内膜增生严重。EVG染色结果显示，实验组和对照组比较，弹性纤维无明显变化，实验组较对照组胶原纤维含量增多。增殖细胞核抗原免疫组化结果显示，实验组可见大量增生细胞，对照组未见增生细胞。结论：大鼠颈动静脉瘘模型制作简单，可作为观察血流动力学变化对血管重建影响的模型。

血流动力学；动静脉瘘；增生；萎缩

0 引言

众所周知，血流动力学变化是静脉血管重建的重要影响因素，但其相关影响机制仍未完全清楚。许多学者通过静动脉移植建立研究模型，但静动脉移植后近期血栓形成发生率高，或者静脉桥血管早期狭窄闭塞时有发生，造模失败在一定程度上阻碍了研究进展，因此建立一种简单可重复的相关研究模型极为重要。笔者认为动静脉瘘作为相关研究模型比较合适。1966年，美国学者Brescia和Cimino通过显微外科技术成功建立了第一例腕部动静脉内瘘[1]，在以后的40多年间动静脉内瘘成为血液透析血管通路构建的首选方法。目前，动静脉内瘘2 a通畅率为65%[2]，一般动静脉内瘘的血液透析治疗过程中4～5 a即会出现血管狭窄闭塞的情况。为了延长动静脉内瘘的使用时间，有学者使用了球囊扩张术、外科手术再通术、远红外线照射、基因转染等技术[3-6]，减少狭窄或使动静脉内瘘二次再通。动静脉瘘技术目前已经非常成熟。笔者建立了大鼠颈动静脉瘘，对动静脉瘘后血管重建进行观测。主要从静脉管壁内膜厚度、管壁细胞增生情况、胶原纤维和弹性纤维含量变化方面进行观测。进一步探讨血流动力学变化和静脉重构之间的关系，检验动静脉瘘模型的适用性。

1 实验资料

1.1 动物、材料和仪器

健康成年SD雄性大鼠30只，质量为300～350g/只，由解放军总医院动物实验中心提供；超声诊断仪（美国Logiq3exp），组织切片机（德国Leica），光学显微镜及照相装置（日本Nikon）。

1.2 实验方法

取30只SD大鼠，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，按35 mg/kg计算用量。使大鼠仰卧于手术台上，通过颈部正中切口，切开皮肤、皮下筋膜和颈阔肌，暴露左侧颈总动脉和颈外静脉，显微镊游离颈总动脉和颈外静脉。整齐切断颈总动脉和（或）颈外静脉，结扎远端血管，近段动静脉吻合造瘘。术后1、2和4周，分别对10只大鼠取材，以动静脉吻合口为中心，静脉端1 cm进行取材，对侧正常静脉1 cm进行取材，观察颈动静脉重建超微结构变化。实验组为颈静脉侧离吻合口1 cm以内段；对照组为对侧颈静脉侧1 cm段。血管吻合采用传统针线缝合方法，缝线为10-0丝线。逐层缝合手术切口，关闭切口，手术时间30 min内。关闭切口前用青霉素4×105万U盐水冲洗切口，术后用100U/mL肝素盐水1mL皮下注射3 d。

1.3 观察方法

1.3.1 大体观察

于手术后1、2和4周，用相同方法腹腔注射麻醉，手术台上暴露左侧颈动静脉瘘，分别行血流夹断通畅实验。

1.3.2 血管超声检查

于手术后1、2和4周，用超声诊断仪（美国Logiq3exp）行颈动静脉瘘检查，观察血管血流通畅情况并作记录。

1.3.3 组织学观察

用血管夹夹持造瘘血管吻合口两端，眼科剪横断血管，用注射器吸生理盐水冲洗离体血管，取吻合口静脉侧血管1 cm、对侧正常静脉1 cm，置于10%福尔马林中，8 h后行冲洗、脱水、浸蜡，石蜡包埋，预切厚度5 μm，组织切片，脱水、透明、苏木精-伊红染色（hematoxyin-eosin staining，HE）和 EVG（Verhoeff's Van Gieson）染色、中性树胶固定。树胶凝固干燥后，在光学显微镜下观察，用ImageProfessionPlus6.0软件测量血管内膜厚度，观测胶原纤维和弹性纤维含量变化。

1.3.4 抗PCNA阳性细胞计数

用增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（abcom[PC10，ab29]）经链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）染色，定位细胞核，阳性细胞为棕黄色。随机计数血管内膜500细胞内阳性细胞比例。实验步骤参照试剂说明书。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 大体观察

术后1、2和4周行大体观察，血管血流均通畅。动物处死后血管纵向切开观察，吻合口处内膜部分增生。

2.2 血管超声检查

术后1、2和4周超声检查，血流通畅，动静脉瘘静脉管腔明显变大。

2.3 组织学观察

术后1周，实验组血管管壁厚度轻微变薄，内膜厚度和对照组间比较无统计学差异；术后2周，实验组血管管壁明显变厚，内膜明显变厚，内膜厚度和对照组间比较有统计学差异；术后4周，实验组血管管壁进一步变厚，内膜厚度和对照组间比较有统计学差异。由图像分析软件测量的内膜厚度结果如图1所示，具体数据见表1。

图1 对照组术后4周和实验组术后1、2、4周静脉管壁图像（HE，×400）

2.4 抗PCNA阳性细胞计数

实验组血管管壁：术后1周，抗PCNA阳性细胞有少量表达，内膜、中膜和外膜可见增殖细胞；术后2周，抗PCNA阳性细胞有较多表达，中膜和内膜多见；术后4周，抗PCNA阳性细胞有大量表达，多分布于内膜增生斑块。对照组血管管壁：各时期抗PCNA阳性细胞极少量或无表达。结果如图2所示，具体数据见表2。

表1 观察时间点血管内膜厚度（±s）μm

表1 观察时间点血管内膜厚度（±s）μm

实验组 6.35±0.74 9.38±0.92 14.75±1.21对照组 6.87±0.52 6.79±0.34 06.41±0.77 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 1周 2周 4周组别 血管内膜厚度

图2 对照组术后4周和实验组术后1、2、4周静脉管壁抗PCNA阳性细胞表达图像（免疫组化，×400）

表2 观察时间点血管内膜PCNA指数（±s）%

表2 观察时间点血管内膜PCNA指数（±s）%

实验组 5.12±0.97 26.68±4.51 30.58±3.16对照组 — 01.82±0.06 01.15±0.02 P值 ＜0.05 ＜0.05 1周 2周 4周组别 血管内膜PCNA指数

2.5 弹性纤维和胶原纤维含量变化

应用EVG染色，各观察时间点弹性纤维含量无明显变化（对照组为（2±0.3）%；实验组术后1周为（2±0.1）%，术后2周为（2±0.3）%，术后4周为（2± 0.2）%）；胶原纤维含量明显增加（对照组为（29± 4.2）%；实验组术后1周为（30±3.2）%，术后2周为（39±3.9）%，术后4周为（47%±5.8）%）。结果如图3所示。

3 讨论

血流动力学变化对血管内膜增生重构的影响很早就被发现[7]，相关研究模型也有很多种，但很少有学者将大鼠颈动静脉瘘作为血流动力学变化对血管重构影响研究的模型。笔者采用的大鼠动静脉瘘模型，对研究血流动力学变化对静脉重构的影响方面具备较多优点。颈动静脉瘘术后4周内，大鼠精神状态好，饮食正常，无死亡发生。动静脉瘘模型制备较简单且成功率高，笔者在前期进行大鼠颈外静脉移植到颈总动脉的模型制备中，发现即使在肝素等药物的干预下血栓发生率仍极高。并且相对于大动物模型，小动物实验饲养成本低，大鼠抗病能力强，更重要的是近年鼠的基因敲除技术应用广泛。笔者建立的大鼠动静脉瘘模型较好地模拟了血流动力学变化和静脉重构的发生。

图3 对照组术后4周和试验组术后1、2、4周静脉管壁胶原纤维和弹性纤维染色图像（EVG，×400）

血流动力学变化引起血管中膜血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）表型改变，进而增殖并向内膜迁移，引起内膜增生，已经被许多学者在动物实验中验证[8]。特别是静脉血管在解剖学上缺乏内弹力膜，与内膜邻近的中膜血管平滑肌细胞对内膜增生的影响更为明显。这一现象在大鼠颈动脉瘘模型中也得到了较好体现。笔者在实验中发现，在术后1周靠近吻合口的静脉处，抗PCNA阳性细胞表达比较明显的部位是血管外膜和内膜，说明外膜和内膜较早参与了血管重构，血管中膜在术后2周和术后4周的血管重构中表现较明显。以前研究重点大多集中在血管中膜，而外膜成肌纤维细胞的表型改变、增殖迁移并未引起足够重视。血管内膜增生重构与血流动力学变化有紧密的联系，而血管外膜的早期重构也许与必然的手术操作等外部机械力损伤关系密切。外膜重构在整个血管重构中的启动作用不可忽视，还需要进一步研究。

血流动力学变化引起血管重构也表现为细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）的变化[9]。通过EVG染色，可以观察到血管重构后，弹性纤维有部分断裂，弹性纤维含量变化不具有统计学意义。术后

（▶▶▶▶）（◀◀◀◀）1周，静脉血管胶原纤维含量未见明显变化，术后2周及术后4周胶原纤维含量却出现了大幅提高。血流动力学变化对血管重构的影响在细胞外基质变化方面有明显体现。细胞外基质为细胞分泌产生，同时细胞外基质对细胞具有支持作用，并对细胞增殖、分化、代谢和迁移起到重要作用。正常静脉，细胞外基质有抑制平滑肌细胞增生的作用。笔者实验中观察到术后4周动静脉瘘吻合口有大量胶原纤维呈现息肉样增生，包含了大量的抗PCNA阳性细胞。在预防动静脉瘘狭窄导致血管功能丧失方面，对胶原纤维的分泌进行调解是一个重要的研究新途径。

大鼠颈动静脉瘘模型制作简单，血流动力学变化对血管重构影响明显，因此不但可以作为动静脉瘘导致血管功能丧失的研究模型，作为血流动力学变化影响血管重构研究模型也同样适用。与其他研究模型相比较，该模型具有经济、实用、成功率高等诸多优点。

[1] Brescia M J，Cimino J E，Appell K，et al.Chronic hemodialysis using venipuncture and a surgically created arteriovenous fistula，1966[J]. J Am Soc Nephrol，1999，10（1）：193-199.

[2] Gh K，Mhs M，H R，et al．Primary patency of native AV fistula：long term follow up[J].Int J Clin Exp Med，2012，5（2）：173-178.

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[9] Majors A K，Ehrhart L A.Cell density and proliferation modulate collagen synthesis and procollagen mRNA levels in arterial smooth muscle cells[J].ExP Cell Res，1992，200（1）：168-174.

（收稿：2014-12-24）

Effect of hemodynamic changes on rat vein reconstruction:model establishing and microstructure observation

GUO Zhan-fang1,LIANG Xiang-dang1,SUN Geng2,ZOU Xiu-qiang3,YU Kuan-kuan1,FANG Zhuo-qun1
（1.No.1 Section of Orthopaedics Department,General Hospital of the PLA,Beijing 100853,China; 2.The 252nd Hospital of the PLA,Baoding 350025,Hebei Province,China）

ObjectiveTo explore the effects of hemodynamic changes on rat vein reconstruction after carotid-jugular arteriovenous fistula.MethodsA total of 30 male SD rats weighting 300 to 350 g underwent common carotid fistula and external jugular fistula.With the arteriovenous anastomoses as the centers,some 1-cm segments at the side of vein were extracted and enrolled in an experiment group,and some 1-cm vein segments at the opposite side were cut off and enrolled into a control group.Hemodynamic changes on rat vein reconstruction were observed 1,2 and 4 weeks after.The segments were split longitudinally and observed grossly,and then underwent hematoxyin-eosin(HE)staining to measure endangium thickness,Verhoeff's Van Gieson(EVG)staining to determine the changes of collagen fiber and elastic fiber,and proliferating cell nuclear antigen(PCNA)immunohistochemistry examination to make clear cellular proliferation.ResultsUltrasound and gross observation showed that the blood flows were smooth in all the groups.HE staining 2 and 4 weeks after found that there was serious endangium hyperplasia in the experiment group.EVG staining showed that the experiment group had the elastic fibers with no obvious difference with those of the control group,while the collagen fibers significantly different from those of the latter.PCNA immunohistochemistry examination proved that there were lots of hyperplastic cells in the experiment group while no ones in the control group.ConclusionRat carotid-jugular arteriovenous fistula model is easy to make, which can be used to observe the effect of hemodynamic changes on vascular reconstruction.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（4）：5-7,11]

hemodynamics;arteriovenous fistula;hyperplasia;analosis

R318

A

1003-8868（2015）04-0005-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.04.005

国家科技部国际合作项目（2014DFA31230）

郭占芳（1981—），男，主治医师，主要从事血管、神经的创伤修复方面的研究工作，E-mail：13321109019@189.cn。

100853北京，解放军总医院骨科一病区（郭占芳，梁向党，邹秀强，余宽宽，房卓群）；071000河北保定，解放军252医院骨科（孙 赓）

梁向党，E-mail：lxd301@263.net