响应面优化酶法制备芝麻饼粕ACE抑制肽研究

王振斌 刘加友 陈兵兵 马海乐 姜美花 骆 琳

（江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013）

响应面优化酶法制备芝麻饼粕ACE抑制肽研究

王振斌 刘加友 陈兵兵 马海乐 姜美花 骆 琳

（江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013）

以芝麻饼粕为原料酶法制备具有降血压活性的血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，在单因素试验基础上进行酶解条件的响应面优化，结果显示芝麻饼粕ACE抑制肽酶法制备的最优条件为pH 8.88，酶解温度46℃，底物质量浓度85 mg／mL，酶解时间24 min。高效液相色谱测得ACE抑制肽的IC50值3.03 mg／mL，进一步经过膜分离，发现经过碱性蛋白酶酶解后，芝麻多肽从平均相对分子质量8 949.62降低到1 721.90，其中酶解液中相对相对分子质量大于10 000的物质仅占1.65%，小于2 000的物质占73.83%，为进一步研究芝麻饼粕ACE抑制肽的制备提供参考。

响应面 芝麻饼粕 ACE抑制肽 碱性蛋白酶

芝麻（Sesamum indicum）是我国四大食用油料作物，制油后的副产品——芝麻饼粕年产量50万t以上，资源丰富。由于对其缺乏系统研究，一直被作为家畜的饲料或农田肥料［1］，其深加工和综合利用的程度不高，鲜见实际生产应用的报道。

杨杰等［2］通过芝麻饼粕蛋白的小鼠急性毒性试验研究，证明芝麻饼粕蛋白作为一种优质的蛋白来源是安全的。蛋白质在人体内并不是全部以单个氨基酸形式被吸收，而以小肽、寡肽吸收，且吸收性比氨基酸强，并且小肽、寡肽具有生物活性。ACE抑制肽在结构上是一种多肽，具有降血压［3］、免疫促进、抗凝血和抗肿瘤等功能。因此将芝麻饼粕作为优良的蛋白源制备ACE抑制肽，提高其利用率，延长芝麻产业链，提高产业附加值具有重要意义。

研究利用响应面优化酶法制备芝麻饼粕ACE抑制肽的条件，采用高效液相色谱和超滤分别测定最优条件下酶解液中多肽抑制ACE的IC50值和相对分子质量，为进一步研究芝麻饼粕ACE抑制肽的制备提供参考。

1 材料和仪器设备

1.1 材料及试剂

芝麻饼粕：徐州新沂吉顺昌油脂科技有限公司；碱性蛋白酶：无锡杰能科生物工程有限公司；猪肺：市售；马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）：Sigma公司；甲醇、乙腈，色谱纯试剂：德国默克MERCK公司；马尿酸标准品、三氟乙酸、氢氧化钠：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

HH－A恒温水浴搅拌器：江苏金坛市中大仪器厂；PHS－3C Precision pH／mv Meter：上海理达仪器厂；DL－5C离心机：上海安亭科学仪器厂；TGL－16高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；LC－20AT高效液相色谱系统：日本岛津公司；ZORBAX Eclipse XEB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）：Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芝麻饼粕主要成分分析

水分测定：直接干燥法，GB 5009.3—2010；灰分测定：高温灼烧法，GB 5009.4—2010；总蛋白测定：凯氏定氮法，GB 5009.5—2010；粗脂肪测定：索氏抽提法，GB／T 5009.6—2003。

1.3.2 碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质

在提取条件为NaOH浓度0.37 mol／L，提取温度75.19℃，提取时间4.7 h，液料比25∶19，提取次数1次，经等电点法（pH 4）制备的芝麻饼粕蛋白质产品，芝麻饼粕蛋白质提取率为76.22%，蛋白的质量分数为58.76%。

1.3.3 不同蛋白酶酶解芝麻饼粕试验

分别选用碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶4种蛋白酶酶解芝麻饼粕蛋白，按照各蛋白酶活性加入相同活力的量，在各自推荐最适条件下进行酶解，测定酶解过程中血管紧张素转化酶抑制率（ACEI）的变化，以此评价不同蛋白酶酶解效果。

1.3.4 芝麻饼粕ACE抑制肽的酶解工艺流程

称取粉碎并过80目筛的芝麻饼粕（2、6、10、14、18 g），加入蒸馏水 100 mL，研究酶解温度（30、40、50、60、70℃），pH值（7、8、9、10、11），碱性蛋白酶加量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U／g），酶解时间（0、3、5、7、10、15、20、30、45、60、75、90、105、120、135、150 min）对酶解产物水解度和ACE抑制活性的影响。整个酶解过程中，用1 mol／L的NaOH溶液不断调整保持pH的稳定，酶解结束后迅速将酶解液置入90℃水浴锅中灭酶15 min。然后5 000 r／min离心15 min，取上清液供测定。

1.3.5 芝麻饼粕ACE抑制肽的酶解条件优化

采用Box－Bohnken中心组合试验设计，根据单因素试验结果分析确定因素水平，以ACEI为响应值，设计4因素3水平的响应面分析试验。以随机次序进行，重复2次，采用Design－Expert软件进行响应面分析优化酶解条件，见表1。

表1 因素水平表

1.3.6 ACE的制备

参考吴琼英［4］的研究方法。取100 g新鲜猪肺冲洗后，剔除大血管和脂肪，切碎，加入4℃的0.1 mol／L硼酸盐缓冲溶液（pH＝8.3）1 000 mL，匀浆，在4℃、转速为5 500 r／min离心30 min，得上清液800 mL。将上清液在冰浴条件下加入（NH4）2SO4160 g，0℃放置2 h，于4℃、转速为5 500 r／min离心40 min，得上清液 800 mL，再在冰浴条件下，加（NH4）2SO4180 g，放置过夜。4℃、转速为5 500 r／min离心 45 min，得到沉淀。用含 NaCl（0.3 mol／L）的0.1 mol／L硼酸盐缓冲液（pH为8.3）溶解上述沉淀，然后在同样的缓冲液中4℃下透析72 h，直到用10%BaCl2溶液检测无白色沉淀为止，再次离心后的上清液在4℃下保存备用。

1.3.7 水解度计算

蛋白质的水解度（Degree of Hydrolysis，DH）采用 pH—stat法［5］。

1.3.8 酶活性的测定

采用Folin酚法，参照SB／T 10317—1999对碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶进行活性测定。

1.3.9 ACE抑制活性与半抑制质量浓度的测定

参考吴琼英［4］的方法进行测定。准确吸取10 μL样品于1.5 mL离心管中，加入25μL ACE（1 ug ACE溶于10 mL的pH 8.3、0.1 mol／L的硼酸缓冲液中，该缓冲液含 0.3 mol／L NaCl），37℃保温 5 min，随后加入6.5 mmol／L HHL 40μL，在37℃恒温反应30 min，然后加入1 mol／L HCl 85μL终止反应，所得反应液用于HPLC分析。用10μL pH 8.3硼酸缓冲液作空白对照试验。HPLC条件：ZORBAX－C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；检测波长228 nm；进样量8μL；柱温25℃；流动相为超纯水 －乙腈（80∶20，各含0.5‰三氟乙酸）；流速1.0 mL／min。计算公式见式（1）。

式中：R为ACEI—ACE抑制率／%；A为空白对照组Hip的峰面积；B为添加ACE抑制肽组Hip的峰面积。

称取一定质量样品配成不同质量浓度的溶液，以质量浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算 IC50值［6］。

2 讨论与分析

2.1 芝麻饼粕组成

芝麻饼粕中水分、脂肪、总蛋白及灰分质量分数测定结果如表2所示。

表2 芝麻饼粕的营养成分／%

2.2 不同蛋白酶对芝麻饼粕的酶解

不同的蛋白酶具有不同的底物特异性及作用位点，因此不同的蛋白酶只能对蛋白质中的某些肽键进行酶解，使得酶解产物的组成、结构及其功能不同。以ACEI为指标比较了4种蛋白酶在最适条件下对芝麻饼粕的酶解效果的结果如图1所示。

由图1可看出，4种蛋白酶中，碱性蛋白酶对芝麻饼粕酶解制备ACE抑制肽的效果最佳，在较短时间内表现出较高的ACE抑制活性，酶解0.5 h时其ACEI质量分数为54.33%。其他3种蛋白酶均具有不同程度的酶解专一性，相较于碱性蛋白酶效果较弱一些。但是经过长时间的酶解反应后，其效果好于碱性蛋白酶。综合考虑，后续试验中采用碱性蛋白酶对芝麻饼粕进行酶解制备ACE抑制肽。

图1 不同蛋白酶酶解芝麻饼粕ACEI与时间变化

2.3 单因素对水解度和ACE抑制率的影响

2.3.1 酶解时间对水解度和ACE抑制率的影响

称取芝麻饼粕10 g，加入蒸馏水100 mL，在pH 8.0、50℃，加酶量为3 000 U／g的条件下，研究酶解时间对DH及ACEI的影响。就酶解时间对芝麻饼粕ACE抑制肽制备过程中水解度变化的影响而言，从图2可以看出，随着酶解时间的延长，DH呈逐渐增大的趋势，其中酶解最初30 min内，DH增大速率较大，30 min时其DH为17.62%，45 min后开始DH变化迟缓，逐渐趋于稳定。分析其原因，是由于在酶解初始阶段，蛋白质分子中可断裂的肽键较多，酶解速度快；而随着酶解时间的继续延长，可酶解的肽键减少的同时，产生的新物质与底物存在竞争性抑制作用导致，酶解速度减缓，DH趋于稳定。

图2 芝麻饼粕DH及ACEI随酶解时间的变化

从图2可看出未酶解（0 min时）的芝麻饼粕也具有较低的活性，其ACEI为3.54%。张婷［7］等在研究厚壳贻贝酶解物的研究时也发现未酶解时含有较低的活性（1.03%）。可能原因是榨油过程易引起芝麻蛋白质的变性，降解生成具有ACE抑制活性的多肽，当底物中加入碱性蛋白酶后，酶解液的ACEI迅速上升，20 min时即达到最大值56.12%，继续酶解ACEI趋于稳定，再缓慢下降趋势。可能是在酶解初始阶段，作为底物的芝麻饼粕质量浓度高，使得具有活性的小分子ACE抑制肽释放出来的速度较快，从而表现出ACEI的迅速增大；反应到一定时间时，其活性物质的生成速率与活性物质降解为无活性物质的速率达到平衡，ACEI趋于稳定；随着反应的进一步进行，底物质量浓度降低，同时产物质量浓度提高，影响酶与底物的有效结合，加之具有活性的ACE抑制肽进一步被酶解成低活性或无活性肽片段，因此ACEI有所下降。

2.3.2 pH对水解度和ACE抑制率的影响

酶活性部位的基团对反应体系的pH变化比较敏感。pH变化导致酶分子的构象及酶分子与底物分子解离状态的变化，从而影响酶与底物的结合而影响反应。称取芝麻饼粕10 g，加入蒸馏水100 mL，50℃，加酶量为3 000 U／g，酶解20 min，研究 pH对DH及ACEI的影响，其酶解过程中DH及ACEI的变化趋势见图3。

图3 pH对DH及ACEI的影响

如图3所示，pH低于10.0时，芝麻饼粕DH呈上升趋势，但pH高于10.0后，DH随pH的升高而下降。而对于ACEI的影响，pH呈现最佳效果与DH时有所差异，pH为9.0时最高，达到59.64%，大于9.0后迅速下降。另外，DH和ACEI没有直接的线性关系。这可能是因为DH与具有ACE抑制活性的肽段序列没有直接的线性关系，不同DH时产生不同序列、不同大小的ACE抑制肽，导致不同的ACE抑制活性。

2.3.3 酶解温度对水解度和ACE抑制率的影响

称取芝麻饼粕10 g，加入蒸馏水100 mL，pH 9.0，加酶量为3 000 U／g，酶解20 min，研究酶解温度对DH及ACEI的影响，其酶解过程中DH及ACEI的变化趋势如图4所示。

图4 酶解温度对DH及ACEI的影响

随着酶解温度的提高，芝麻饼粕DH呈上升趋势，在60℃达到最大值20.66%；当温度继续上升时，DH迅速下降。虽然ACEI与DH达到最大值时的温度不一样，但是变化趋势相似，在50℃达到最大值，其质量分数为59.23%；当超过此温度时，ACEI反而下降。这是因为随着酶解温度的提高，酶的活力增强，同时物质的扩散速度增加，从而表现出酶解速度加快，DH及ACEI增大；继续升高温度，酶的变性几率增大，活力下降，且很多杂质也会被提出。为获得高活性的芝麻饼粕ACE抑制肽，选50℃为最适温度。

2.3.4 底物质量浓度对水解度和ACE抑制率的影响

分别称取 2、6、10、14、18 g芝麻饼粕，加入蒸馏水 100 mL，50℃，pH 9.0，加酶量为 3 000 U／g，酶解20 min，研究底物质量浓度对DH及ACEI的影响。

图5 底物质量浓度对DH及ACEI的影响

从图5可以看出，其他条件相同时，当底物质量质量浓度从20 mg／mL变为60 mg／mL时，DH分别为14.06%和14.33%；当底物质量浓度继续增大时，DH反而呈下降趋势；底物质量浓度从20 mg／mL变为60 mg／mL时，ACEI由56.80%上升到59.35%，随着底物质量浓度继续增大，其ACEI呈下降趋势。可能是在相同条件下，底物质量浓度小时，相同剂量的酶能够充分作用于底物；而底物质量浓度过大，物料传质受阻或多个底物分子占据酶的部分活性位点，影响酶与底物的有效接触。考虑到生产成本以及后期分离浓缩的困难，确定85 mg／mL的底物质量浓度进行酶解较适宜。

2.3.5 加酶量对水解度和ACE抑制率的影响

称取芝麻饼粕10 g，加入蒸馏水100 mL，50℃，pH 9.0，酶解20 min，此时观察加酶量对DH及ACE抑制率的影响。由图6可看出，当底物质量浓度一定时，随着加酶量的增加，其DH逐渐增大。这可能是因为酶能够与底物充分结合，促进酶解反应。

图6 加酶量对DH及ACEI的影响

加酶量从1 000 U／g变化到2 000 U／g时，ACEI迅速增大，达到最大值61.77%；而加酶量继续增大，ACEI反而略有下降。分析其原因可能是加酶量较少时，底物尚未与酶充分结合；而酶用量过大，则出现饱和现象，造成酶浪费的同时也会导致产物过度酶解的现象。此外，实际生产中宜尽量采用较低酶添加量，以降低成本；并且在较低酶添加量条件下，产物的DH易于控制；同时本试验结果也显示，较低的酶添加量呈现较高的活性。因此，本试验适宜加酶量选为2 000 U／g。

2.4 芝麻饼粕ACE抑制肽制备技术的响应面优化

2.4.1 试验设计及结果

基于单因素试验结果分析，加酶量定为2 000 U／g，以ACEI为响应值，采用RSM法来寻求酶解最优工艺参数。Box－Behnken试验设计及结果见表3，并利用Design－Expert对响应面试验结果进行方差分析（见表4）。

各因素经二次多项回归拟合后，得到ACEI（Y）与酶解时间、pH、酶解温度、底物质量浓度4个因素的二次多项回归方程为：

表3 响应面设计方案和试验结果

表4 方差分析

从表4的方差分析结果可以看出，模型极显著，失拟项不显著，回归模型可以用来拟合4个因素对酶解物ACEI的影响。证明回归方程与实际数据之间具有良好的拟合性。从因素X1、X2、X3、X4对 ACEI的影响来看，方程的一次项X1、X2和X4，二次项X12、X22、X32及X42，交互项X1X3和X2X4均显著，且影响顺序依次为：pH＞酶解时间＞底物质量浓度＞酶解温度。这说明响应值的变化十分复杂，试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次关系。根据回归方程，利用Design－Expert作因子间的响应面分析图。

通过分析计算得到酶法制备ACE抑制肽的最优条件为：酶解时间为23.85 min，pH为8.88，酶解温度为45.69℃，底物质量浓度为8.37%，此条件下，得到的ACEI预测值为59.06%。

2.4.2 验证试验

为表明响应面模型的合适性和有效性，进行验证试验。在pH 8.88，酶解温度为46℃，底物质量浓度为8.5%，加酶量为2 000 U／g，酶解24 min，重复3次，ACEI实测值为（57.95±0.53）%，接近模型预测值59.06%。

2.4.3 芝麻饼粕ACE抑制肽半抑制质量浓度测定

按照最优条件制备ACE抑制肽，分别稀释2、4、8、16、32、64倍，测定不同质量浓度酶解液对ACE的抑制作用。

结果表明，芝麻饼粕酶解液对ACE活性具有一定的抑制作用，并且酶解液的质量浓度越高，对ACE的抑制作用越显著。通过测定不同质量浓度的酶解液对HHL作用生成的马尿酸质量分数计算出IC50值，经计算得到芝麻饼粕 ACE抑制肽的 IC50值为3.03 mg／mL。

2.4.4 相对分子质量分布分析

对碱提芝麻蛋白和芝麻饼粕酶解液的相对分子质量分布分析，结果如表5所示。

从表5中可看出碱提芝麻蛋白中相对分子质量大于5 000的物质质量分数高达78.74%，其中大于10 000的物质质量分数接近50%，平均相对分子质量为8 949.62；经碱性蛋白酶酶解后得到的酶解液中相对分子质量大于10 000的物质仅占1.65%，小于2 000的物质占73.83%，平均相对分子质量为1 721.90，说明芝麻蛋白大部分已酶解成小分子肽。

表5 碱提芝麻蛋白和芝麻饼粕酶解液的相对分子质量分布／%

3 结论

在碱性蛋白酶水解芝麻饼粕单因素试验基础上，采用响应面设计进行试验优化，确定最优酶解条件为pH 8.88，酶解温度46℃，底物质量浓度85 mg／mL，加酶量2 000 U／g，酶解 24 min，在此条件下ACEI实测值为（57.95±0.53）%。按照最佳酶解条件制得的芝麻饼粕酶解液对ACE活性具有一定的抑制作用，经计算得出芝麻饼粕ACE抑制肽的IC50值为3.03 mg／mL。碱提芝麻蛋白中相对分子质量大于5 000的物质质量分数高达78.74%，其中大于10 000的物质质量分数接近50%，平均相对分子质量为8 949.62；经碱性蛋白酶酶解后得到的酶解液中相对分子质量大于10 000的物质仅占1.65%，小于2 000的物质占73.83%，平均相对分子质量为1 721.90，说明芝麻蛋白大部分已酶解成小分子肽。为以后进一步研究芝麻饼粕ACE抑制肽的制备提供参考。

［1］王长平，付钧钧，薛勇，等.芝麻饼营养特性及其在养鸡生产中的应用［J］.中国家禽，2010，13（32）：44－46

［2］杨杰，董英，邵元龙.芝麻饼粕蛋白急性毒性试验研究［J］.食品科技，2009，8（34）：68－70

［3］皇家音，朱禹洁，沈金玉.降血压肽研究进展［J］.食品与发酵工业，2006，6（32）：81－86

［4］吴琼英.降血压发酵乳的制备及其性能研究［D］.镇江：江苏大学，2004

［5］Nissen J A.Enzymatic hydrolysis of food protein［M］.New York：Elsevier Applied Science Publisher，1986

［6］Roy M K，Watanabe Y，Tamai Y.Yeast protease B－digestd skim milk inhibits angiotensin－I－enzyme activity［J］.Biotechnol Appl Biochem，2000，31：95－100

［7］张婷.厚壳贻贝酶解物的制备及其降血压肽的分离纯化［D］.杭州：浙江工商大学，2009.

The Response Surface Optimizate Preparation of Sesame Dregs’Ace Inhibitory Peptides with Enzyme

Wang Zhenbin Liu Jiayou Chen Bingbing Ma Haile Jiang Meihua Luo Lin

（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

The angiotensin－I－converting enzyme（ACE）inhibitory peptides have been prepared from sesame dregs by enzyme hydrolysis.The conditions of enzyme hydrolysis were optimized by Response Surface Method based on single factor design.The optimal conditions of sesame dregs ACE inhibitory peptides preparation were as follows：pH 8.88，enzymolysis temperature at 46℃，substrate concentration of 85 mg／mL and time of 24 min.The IC50of ACE inhibitory peptides was identified by high performance liquid chromatography（HPLC）to be 3.03 mg／mL.After being processed by membrane separation analysis，the peptide average molecular weight decreased from 8 949.62 to 1 721.90，and the peptide molecular less than 2 000 had the weigh of 73.83%.These conclusions could provide a basis theoretical for further study of sesame dregs ACE inhibitory peptides preparation.

response surface，sesame meal，ACE inhibitory peptides，alkaline protease

TS229

A

1003－0174（2015）09－0088－06

苏北科技发展计划（BC2012421），江苏高校优势学科建设工程资助（苏政办发［2014］37号），江苏省高等学校大学生实践创新训练计划（201310299019Z），江苏大学大学生科研立项资助（12A018）

2014－02－10

王振斌，男，1975年出生，教授，天然产物分离及应用

马海乐，男，1963年出生，教授，天然产物分离及应用