中黄13大豆发芽期间异黄酮类成分变化规律的研究

王慧芳 来吉祥 王东晖 方 芳 王凤忠 吴 韬

（农业部农产品加工重点实验室中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

中黄13大豆发芽期间异黄酮类成分变化规律的研究

王慧芳 来吉祥 王东晖 方 芳 王凤忠 吴 韬

（农业部农产品加工重点实验室中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

以中黄13大豆中异黄酮β－糖苷、糖苷配基、游离多酚及总黄酮为指标，观察上述功能成分在发芽期间的动态变化，从而明确发芽时间对功能成分的影响规律。采用比色法及超高效液相（UPLC）法，分析大豆在发芽第1天至第7天内上述功能成分的变化情况。结果表明：发芽时间对大豆中糖苷配基、游离多酚及总黄酮的含量影响显著（P＜0.05），大豆苷元、游离多酚及总黄酮于发芽第7天时含量达到最高，分别为286.40μg／g、0.47 mg GAE／g d.m.和11.86 mg RE／g d.m.；黄豆黄素和染料木素于发芽第5天时含量达到最高，分别为353.22和336.14μg／g。发芽期间β－糖苷含量先上升后逐渐下降，而糖苷配基则主要呈增加趋势。因此，发芽有助于中黄13大豆中异黄酮类成分的提高，其可作为功能性大豆产品进一步被开发。

大豆 发芽 异黄酮 β－糖苷 糖苷配基

大豆（Glycinemax（L）.Merr.）是我国四大油料作物之一，因其富含蛋白质、异黄酮等多种功能性活性成分而在我国传统饮食中扮演着重要角色。异黄酮的化学结构与人类雌激素结构相似，因此又被称为植物雌激素［1］。众多研究表明［2－6］，大豆异黄酮是一种对人体天然、安全高效的调节剂，其具有改善皮肤水分及弹性状况、缓解更年期综合症、改善骨质疏松、降低血液胆固醇、预防心血管疾病、抗癌抗氧化等多重生理功能。然而在大豆种子中，异黄酮含量仅为 1～5 mg／g［7］，远不能满足人体需求；发芽作为一种经济有效的加工方式，能够打破大豆种子的休眠状态，将其内源酶激活［8－9］，使其生理生化代谢反应加快，提高大豆种子中异黄酮含量［10］。大豆中异黄酮的形成受多重因素的影响，除遗传因素外，大豆品种及发芽时间都会对异黄酮含量的累积产生一定的影响［11］。在我国，通过国家及各省区域试验审定的大豆品种已逾千种，其化学成分因品种不同而存在差异。中黄13大豆具有高蛋白、多抗性、高产稳产、适应性广等优良特性，是近年来我国大面积推广栽培的大豆主导品种之一［12－14］。目前，对于中黄13大豆的研究主要集中在蛋白质等基本营养素方面，有关发芽条件对其异黄酮单体的种类及含量的影响鲜有深入研究。因此，本研究以我国优质大豆中黄13为试验材料，对其进行发芽处理，分析其发芽过程中游离多酚、总黄酮及6种异黄酮单体的变化情况，为今后开发功能性大豆产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中黄13大豆：中国农业科学院作物科学研究所，2013年采收。

没食子酸（Gallic Acid，GA）、芦丁（Rutin，R）标准品：美国Sigma公司；大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素（纯度≥98%）标准品：上海阿拉丁试剂公司；乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

RXZ人工气候箱：宁波市江南仪器厂；LGJ－25C冷冻干燥机：北京市四环科学仪器厂有限公司；高速多功能粉碎机（SL－100型）：浙江省永康市松青五金厂；CR22G II日立高速冷冻离心机：日本HITACHI公司；酶标仪Spectra Max 190：美国Molecular Devices公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发芽大豆样品的制备

挑选籽粒饱满且无病虫害的大豆种子1 000 g，分别用蒸馏水清洗5次，除去大豆表面杂质和悬浮瘪粒；用0.25%NaClO溶液室温下处理30 min后，1 000 mL蒸馏水清洗5次，再用1∶5（W∶V）的蒸馏水30℃下浸泡10 h［15］。将浸泡后的大豆种子表面水分沥干，置于垫有2层纱布的培养盘（底部有孔）中，均匀摊开，放于温度为30℃，RH为95%的人工气候箱中避光培养，因发芽7 d后易出现腐败现象，故对其发芽限制在7 d内，并每隔24 h取出样品100 g，立即用液氮进行速冻后，放于冷冻干燥机中真空干燥。将干燥样品粉碎，过60目筛得发芽样品，放于－20℃下保存备用。

1.3.2 发芽样品提取液的制备

称取20 g发芽样品，置于锥形瓶中，加入适量正己烷，封口膜密封后，室温200 r／min下水浴振荡脱脂4 h，通风条件下将正己烷完全挥发，再冷冻干燥，得脱脂样品［16］。称取0.5 g脱脂样品，按料液比1∶20加入10 mL甲醇，涡旋充分混合，室温下超声提取2次，每次30 min，然后10 000 r／min高速离心10 min，取上清液，合并2次上清后放于4℃下保存，备用。

1.3.3 游离多酚含量的测定

采用 Folin－Ciocalteu法［17］，以没食子酸为标准品对其游离多酚进行测定。分别移取25μL各质量浓度标准溶液（0、25、50、100、200、300μg／mL）及稀释10倍的样品溶液于96孔板中，加入125μL福林酚试剂；10 min后，加入125μL 7.5%Na2CO3；反应30 min后，用酶标仪在765 nm下测其吸光值。游离多酚含量以没食子酸当量表示，即mg GAE／g d.m.。

1.3.4 总黄酮含量的测定

采用AlCl3比色法［17］，以芦丁为标准品对其总黄酮进行测定。移取20μL NaNO2于96孔板中，分别加入50μL各浓度标准溶液（0、31.25、62.5、125、250、500μg／mL）以及样品溶液于室温下反应5 min后，加20μL 0.3 mol／L AlCl3溶液室温下反应6 min，加200μL 0.5 mol／L NaOH；反应30 min，用酶标仪在510 nm下测其吸光值。总黄酮含量以芦丁当量表示，即 mg RE／g d.m.。

1.3.5 UPLC分析提取液中异黄酮组分

1.3.5.1 色谱条件

美国Waters公司AcquityTMUPLC液相色谱系统（配AcquityTMPDA检测器）；色谱柱：Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100×2.1 mm，1.7μm）；流动相A：甲醇，流动相B：0.1% 三氟乙酸；梯度洗脱程序：0～1 min，15%～20%A；1～2 min，20%～30%A；2～5 min，30%～70%A；5～6 min，70%～100%A；6～7 min，100%～100%A；7～8 min，100%～15%A；8～12 min，15%A。流速：0.3 mL／min；检测波长：260 nm；柱温：25℃；样品温度：10℃；进样量：2μL。

1.3.5.2 对照品溶液的制备

精密称量6种异黄酮组分标品各10 mg，分别用甲醇定容于10 mL容量瓶中，摇匀，得1.0 mg／mL对照品储备溶液；分别移取对照品储备液0.5 mL，用初始流动相定容于同一10 mL容量瓶中，得50μg／mL大豆异黄酮混合对照品中间溶液，4℃下避光保存备用；分析测定时稀释到相应浓度［18］。

1.3.5.3 样品中异黄酮组分的分析测定

分别移取1.3.2中样品提取液及大豆异黄酮混合对照品中间溶液，过0.22μm有机膜，UPLC分析。

1.4 数据分析

应用Excel 2007及SAS 9.1软件进行数理统计及方差分析，由Duncan检验分析均值差异显著性（P＜0.05）。每个试验均重复3次，结果均表示为：平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 发芽对大豆中游离多酚的影响

由图1知，30℃下发芽时，中黄13大豆中游离多酚含量呈上升趋势。发芽前，多酚含量为0.10 mg GAE／g d.m.；随着发芽时间的延长，大豆中多酚含量逐渐上升，第1天至第5天增加缓慢，第6天至第7天增加较快，且第7天时含量达到最高（0.47 mg GAE／g d.m.），与发芽前相较，游离多酚含量增加了370.0%。可能原因为，发芽期间大豆种子中结合态多酚转化为游离态多酚从而使其含量增加；本研究第7天多酚含量高于相关人员对大豆发芽5 d后分析出的最高多酚含量（0.44 mg GAE／g d.m.）［19］，这可能由于大豆品种不同所致。此外，发芽时间对游离多酚的含量影响显著（P＜0.05），且发芽第7天对游离多酚含量影响极显著（P＜0.01）。可见，发芽有助于中黄13大豆中游离多酚的累积，且发芽第7天为中黄13大豆富集游离多酚的最佳时间。

图1 中黄13大豆发芽过程中游离多酚动态变化

2.2 发芽对大豆中总黄酮的影响

由图2知，30℃下发芽时中黄13大豆中总黄酮含量呈上升趋势。发芽前，总黄酮含量为6.90 mg RE／g d.m.；随着发芽时间的延长，大豆中总黄酮含量逐渐上升，发芽初期增加缓慢，第6天至第7天时增加较快，且第7天时，总黄酮含量达到最高（11.86 mg RE／g d.m.），与发芽前相较，总黄酮含量增加了71.9%。本结果与前人［7］研究相较，总黄酮含量略高，原因可能为大豆品种不同所致。此外，发芽时间对大豆中总黄酮含量影响显著（P＜0.05），且发芽第7天对中黄13大豆中总黄酮含量影响极显著（P＜0.01）。可见，发芽有利于大豆中总黄酮含量的提高，且发芽第7天为中黄13大豆富集黄酮的最佳时间。

图2 中黄13大豆发芽过程中总黄酮动态变化

2.3 发芽对大豆中6种异黄酮单体的影响

中黄13大豆发芽期间6种异黄酮单体发芽前后变化色谱图见图3。异黄酮作为大豆中的一类重要生物活性物质，包括糖苷配基和糖苷2大类组分［20］。本研究分析了大豆发芽过程中6种异黄酮单体（3种糖苷单体和3种糖苷配基单体）的动态变化，如图3所示，β－糖苷单体（大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷）的保留时间分别为4.535、4.650及5.479 min，糖苷配基单体（大豆苷元、黄豆黄素、染料木素）的保留时间分别为6.088、6.174及6.500 min；各组分分离度均大于1.2，实现了组分之间的很好分离。因此，该色谱方法适于分析大豆中异黄酮单体的变化情况。

图3 中黄13大豆发芽前后6种异黄酮单体UPLC色谱图

图4 中黄13大豆发芽过程中6种异黄酮单体的动态变化

6种异黄酮单体含量动态变化见图4。发芽期间，大豆苷和黄豆黄苷在6种单体中含量相对较高，是中黄13大豆的2种主要异黄酮β－糖苷单体。发芽前，大豆苷及黄豆黄苷的含量分别为535.9、200.2μg／g；发芽第1天时，黄豆黄苷含量达到最高（308.04μg／g），第3天时大豆苷含量达到最高（852.12μg／g）；到后期，2种单体含量逐渐下降，并均于第7天降至最低。大豆种子吸水萌发后，染料木苷含量先增加后逐渐下降，到第5天时，含量降至最低（18.38μg／g），且与发芽前相较，下降了17.9%。大豆苷元、黄豆黄素及染料木素，三者具有相似的化学结构，是大豆中3个重要的异黄酮糖苷配基单体。发芽第7天，大豆苷元含量达到最高（286.40μg／g），是发芽前的507.3倍；第3天时含量最低（59.05μg／g），但与发芽前相较，仍增加了25.2%。黄豆黄素及染料木素在第5天时含量均达到最高，较发芽前，分别增加了2 924.1%、2 448.4%。在发芽过程中，大豆苷元的合成累积早于染料木素，而发芽第2天至第7天，染料木素累积速度大于大豆苷元，这可能由于大豆苷元与染料木素的合成累积与其各自合成路径有关［21］；发芽第6天至第7天，染料木素及黄豆黄素含量均有所下降，原因可能为其在发芽后期转化为其他异黄酮组分［10］。

大豆发芽过程中异黄酮总量、β－糖苷及糖苷配基含量动态变化见图5。

图5 中黄13大豆发芽过程中异黄酮糖苷及糖苷配基动态变化

发芽前，异黄酮总量为829.79μg／g；随着发芽时间的延长，异黄酮总量逐渐升高，且于第5天时含量达到峰值（1 705.86μg／g），并与发芽前相较，提高了105.6%。β－糖苷和糖苷配基作为异黄酮的2类组分，在中黄13大豆发芽期间，含量均呈现先增加后下降趋势，且β－糖苷含量一直高于糖苷配基。发芽前，β－糖苷含量为757.76μg／g；发芽期间，含量变化范围为682.39～1 182.49μg／g；其中第3天时，含量最高（1 082.49μg／g），与发芽前相较，增加了55.5%；第4天至第7天，β－糖苷量逐渐下降。该结果表明，随着发芽时间的延长，β－糖苷总量不断降低。糖苷配基在发芽前，含量为72.03μg／g；发芽期间，其含量变化范围为179.74～791.01μg／g，其中第5天时含量最高（791.01μg／g），与发芽前相较，增加了998.2%。虽在发芽第6天至第7天，糖苷配基含量有所下降，但在发芽7 d中，整体趋势是增加的。发芽第1天，糖苷配基含量最低，但仍比发芽前高65.8%，即发芽期间糖苷配基的最低量均要高于发芽前的含量。由此说明，发芽有利于糖苷配基含量的增加。

综上所述，30℃下发芽有利于中黄13大豆中异黄酮含量的累积，且发芽期间异黄酮β－糖苷含量先上升后下降，糖苷配基则主要表现为增加，可能原因是在发芽过程中发生了β－糖苷向糖苷配基的转化，且与苯丙烷类代谢［22］和丙二酸代谢［8］途径中的三羧酸循环及辅酶A循环密切相关。此外，本研究中异黄酮最高含量高于Akitha等［23］对大豆发芽5 d后分析所得最高异黄酮含量（602～794μg／g），说明中黄13大豆在富集异黄酮方面有较强优势。

3 结论

通过研究发现，发芽能够显著提高中黄13大豆中大豆苷元、游离多酚及总黄酮的含量（P＜0.05），且发芽第7天时三者含量均达到最高，分别为286.40μg／g，0.47 mg GAE／g d.m.和 11.86 mg RE／g d.m.；第5天时黄豆黄素和染料木素含量达到峰值，分别为353.22和 336.14μg／g；发芽过程中β－糖苷含量先增加后逐渐下降，而糖苷配基则主要呈上升趋势，并于发芽第5天，与异黄酮总量同时达到最高。因此，发芽有助于异黄酮类成分的提高，且在发芽过程中发生了β－糖苷向糖苷配基的转化，从而实现了中黄13大豆中异黄酮含量的增加；同时说明富含异黄酮类成分的发芽中黄13大豆可作为被开发为功能性大豆产品的潜在品种。

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Kinetic Changes of Isoflavone Components During Germination in Zhonghuang 13 Soybean

Wang Huifang Lai Jixiang Wang Donghui Fang Fang Wang Fengzhong Wu Tao

（Key Laboratory of Agro－Products Processing，Ministry of Agriculture，Institute of Agro－Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

β－Glucosides，aglycones，free phenolic and total flavonoid was took as indexes to observe and define the kinetic changes of functional ingredients during germination period by colorimetric method，using ultra performance liquid chromatography（UPLC）on selected Zhonghuang 13 soybean.The results showed that germination time had a significant influence on the accumulation of aglycones，free phenolic and total flavonoid within soybean（P＜0.05）.The contents of the elements above had reached the maximum on 7 d as follows：286.40μg／g，0.47 mg GAE／g d.m.and 11.86 mg RE／g d.m.，respectively；and the contents of glycitein and genistein had reached the maximum as follows：353.22μg／g and 336.14μg／g respectively on 5 d.The content ofβ－glucoside first increased and gradually decreased；while the aglycone showed a trend of increasing mainly during germination.Therefore，germination is conducive to the improvement of isoflavone components of the Zhonghuang 13 soybean，which can be used as functional soybean products to be developed furthering the future.

soybean，germination，isoflavone，β－glucosides，aglycones

TS201.2

A

1003－0174（2015）09－0013－05

中国农业科学院基本科研业务（2014ZL042）

2014－04－17

王慧芳，女，1990年出生，硕士，营养健康与功能食品

王凤忠，男，1972年出生，研究员，功能食品与生物活性物质

吴韬，男，1973年出生，研究员，天然产物化学结构鉴定及功能食品评价开发