菜籽粕中清蛋白的超声辅助提取及氨基酸组成研究

赵 蓓 王承明 张沙沙

（华中农业大学食品科技学院，武汉 430070）

菜籽粕中清蛋白的超声辅助提取及氨基酸组成研究

赵 蓓 王承明 张沙沙

（华中农业大学食品科技学院，武汉 430070）

以脱脂菜籽粕为原料，在单因素试验基础上采用响应面分析方法优化菜籽清蛋白的超声辅助提取工艺，研究液料比、提取时间、超声温度、超声功率对菜籽清蛋白提取率的影响；并对得到的产品进行氨基酸组成分析。结果表明，最佳的工艺条件为液料比18 mL/g，提取时间62 min，超声温度42℃，超声功率80 W，且最优条件下实际提取率为8.53%；氨基酸分析结果显示，菜籽清蛋白中氨基酸种类齐全，必需氨基酸组成均衡，符合FAO/WHO推荐模式，是一类优质的植物蛋白资源。

菜籽清蛋白 超声辅助 优化 氨基酸组成

根据植物蛋白在不同溶剂中的溶解性差异，可分为水溶性（清蛋白）、盐溶性（球蛋白）、碱溶性和醇溶性蛋白质。菜籽中主要的蛋白质包括2S清蛋白和12S球蛋白，分别占蛋白质总含量的13.4%～46.1%和25%～65%[3]。此外，还有分子量较小的如硫堇、胰岛素抑制剂和脂转移蛋白质（lipid transfer protein，LTP），这些蛋白组分不仅理化性质良好，而且具有较强的生物活性[4]，其中2S清蛋白中含硫氨基酸、赖氨酸含量相对较高，功能性质方面优于12S球蛋白[5]。

目前，菜籽蛋白的研究多以自制冷榨菜籽粕为原料，提取方法主要有水相法和有机溶剂法[6－7]。薛照辉等[8]通过对等电点沉淀法和饱和硫酸铵法的研究对比，探讨了如何提高冷榨菜籽粕中分离蛋白的提取率；熊志勇等[9]测定了中双119甘蓝型油菜脱壳脱脂风干菜籽粕中水溶性、盐溶性、碱溶性和醇溶性蛋白质占总蛋白含量分别为40.0%、34.9%、23.1%和1.9%。Chabanon等[10]对菜籽蛋白（清蛋白和球蛋白）进行酶法水解，改善其水解物功能性质。超声波技术作为一种近年发展起来的物理提取方法，具有操作简便、提取时间短、提出率高等特点，目前己开始应用在生物活性物质的提取方面[11]。本研究主要以传统热榨菜籽粕为原料，采用超声辅助提取菜籽清蛋白并进行工艺优化，对提取得到的菜籽清蛋白样品进行氨基酸组成分析，旨在为其开发利用提供有力的参考依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菜籽饼粕：益海嘉里（武汉）粮油工业有限公司，粉碎后过60目筛，石油醚脱脂。

1.2 主要仪器

AL204分析天平：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；DF－101S集热式恒温加热磁力搅拌器：武汉科尔仪器设备有限公司；KQ 2200DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪：济南海能仪器有限公司；TDL－5－A台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；RE－2000B旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 超声波辅助提取与搅拌浸提菜籽清蛋白对比试验

取10 g菜粕置于烧杯中，加入150 mL去离子水，40℃下超声辅助提取60 min，同条件下搅拌浸提作对比。5 000 r/min离心15 min后测定上清液中蛋白质含量，离心后沉淀重复提取4次并测定蛋白总提取率。

1.3.2 提取工艺的优化设计

1.3.2.1 单因素试验

以清蛋白的提取率为判断依据，选取不同的液料比、提取时间、超声温度、超声功率为影响因素，进行菜籽粕中清蛋白提取的单因素试验。

为了突破由“六级修”维修工作量时间集中性明显而导致的维修作业年度时间段内工作量分布不均、车辆上线率不高的维修集约瓶颈，“均衡修”维修集约范式将“工作量均衡化”作为维修程式变化的核心理念，制定出分散到12个月度的、工作量相对平均的12项维修活动，如表3所示。同时，该维修集约范式充分利用车辆运营高峰回库的窗口时间，完成维修作业内容。

1.3.2.2 响应曲面法优化设计

在单因素试验基础上，根据Box－Behnken试验设计原理，选取液料比、提取时间、超声温度及超声功率为影响因素，清蛋白提取率为响应值，采用四因素三水平响应面法进行试验，因素水平编码见表1。

1.3.3 氨基酸组成分析

样品制备：将蛋白质提取液进行浓缩，采用75%饱和硫酸铵分离蛋白质，醇洗沉淀后进行透析，最后真空冷冻干燥得到清蛋白粉末。

氨基酸的测定参照GB/T 5009.124—2003。取适量清蛋白粉末进行酸水解成游离氨基酸后，经氨基酸分析仪分析其氨基酸组成。

色氨酸的测定参照GB 7650—1987。

1.3.4 蛋白质的测定

蛋白质含量根据GB/T 5009.5—2010采用半微量凯氏定氮法。

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取与搅拌提取的对比结果

为提高菜籽清蛋白的提取率，分别进行超声辅助和搅拌提取，结果见图1。超声辅助提取时的菜籽清蛋白提取率要高于搅拌提取时的提取率，并且总趋势均随提取次数的增加而增加，提取4次后清蛋白提取率接近平衡，从节约溶剂和能源的角度考虑，后续试验优化可选择提取1次。

图1 提取次数对提取率的影响

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液料比对清蛋白提取的影响

取10 g菜籽粕依不同比例加入相应体积的去离子水，40℃、70 W超声辅助浸提1 h，离心后测上清液中蛋白质含量，考察液料比对清蛋白提取率的影响。由图2可看出，随着液料比的增大，菜籽清蛋白的提取率先呈上升趋势，当液料比为15 mL/g时达到最高，大于15 mL/g提取率有所下降。当液料比小时，提取液浓度过高，体系黏度大，造成蛋白分离困难；随着溶剂的增加，有效成分浸出越完全，提取率就越大；但当溶剂量过大时，超声对菜籽粕颗粒产生的空化和机械效应强度减弱，从而影响超声对清蛋白的提取效果，同时会造成溶剂的浪费。因此，液料比可确定为15 mL/g。

图2 液料比对提取率的影响

2.2.2 提取时间对清蛋白提取的影响

取10 g菜籽粕，选取液料比15 mL/g，40℃、70 W超声辅助浸提不同时间，离心后测上清液的蛋白质含量，考察提取时间对清蛋白提取率的影响。由图3可看出，随着提取时间的增加，菜籽清蛋白的提取率不断增加，在60 min后增加变得缓慢，并趋于平稳。因为短时间内受到超声空化作用，蛋白质会充分与提取溶剂接触，溶出率增加并随着时间延长慢慢达到动态平衡，时间过长会造成能源浪费。因此，提取时间可确定为60 min。

图3 提取时间对提取率的影响

2.2.3 超声温度对清蛋白提取的影响

取10 g菜籽粕，选取液料比15 mL/g，不同温度下70 W超声辅助浸提1 h，离心后测上清液的蛋白质含量，考察温度对清蛋白提取率的影响。由图4可看出，随着超声温度的升高，菜籽清蛋白的提取率不断增大，在40℃后逐渐趋于平衡。温度升高后，菜籽粕中的其他成分如水溶性色素也会溶出，使蛋白提取液色泽加深，而且温度过高易使蛋白质发生变性，给后续操作带来一定的困难，同时会造成能源损失。综合考虑，超声温度可确定为40℃。

图4 温度对提取率的影响

2.2.4 超声功率对清蛋白提取的影响

图5 超声功率对提取率的影响

取10 g菜籽粕，选取液料比15 mL/g、40℃，不同功率下超声辅助浸提1 h，离心后测上清液的蛋白质含量，考察超声功率对清蛋白提取率的影响。由图5可看出，随着超声功率的增加，菜籽清蛋白的提取率呈缓慢上升趋势，在80 W时达到最高值。菜籽粕在受到加热的同时，随着超声空化作用的增强，清蛋白提取率随之增加；但高功率导致的热效应会使蛋白发生部分变性，从而导致某些性质的改变，为其应用造成限制。因此，超声功率可确定为80W。

2.3 Box－Behnken试验优化结果

在单因素试验结果的基础上，选取液料比、提取时间、超声温度及超声功率4个因素进行Box－Behnken试验设计，共进行29次试验，各因素安排及结果见表2。

表2 Box－Behnken试验设计及结果

利用Design－Expert8.0.5软件对Box－Behnken试验结果进行多元回归拟和，可得到清蛋白提取率对液料比（A）、提取时间（B）、超声温度（C）及超声功率（D）的二次多项回归模型为：

清蛋白提取率 ＝8．27＋0．54A＋0．21B＋0．33C＋0．15D－0．095AB＋0．072AC＋0．057AD－0．042BC－0．01BD＋0．018CD－0．41A2－0．42B2－0．54C2－0．57D2

对该模型进行方差分析和显著性检验，模型方差分析结果见表3，回归模型系数的显著性检验结果见表4。

表3 回归模型方差分析

表4 回归模型系数的显著性检验

由表3方差分析结果可知，该模型P＜0.000 1，可看出回归模型效果极显著；失拟项P＝0.135 6＞0.05不显著；相关系数R2为0.916 8，说明该模型拟合较好，试验误差小，可以用此模型来分析预测清蛋白的提取率。

由表4回归模型系数的显著性检验结果可以看出，该模型的一次项A（液料比）、C（超声温度）影响极显著，二次项均极显著；一次项B（提取时间）影响显著；一次项D（超声功率）、交互项影响不显著，各因素的影响大小依次为：A＞C＞B＞D。

对菜籽清蛋白的提取条件进行优化，剔除回归模型中不显著项后，最佳提取工艺参数为：液料比18.4mL/g，提取时间61.5min，超声温度41.7℃，超声功率81.7W，此时的理论提取值为8.55%。为验证Box－Behnken试验设计结果的可靠性，选取条件为液料比18 mL/g，提取时间62 min，超声温度42℃，超声功率80 W，平行提取3次，平均提取率为8.53%，与理论预测值接近，其相对误差为0.23%。

2.4 氨基酸组成分析

在营养学上常用氨基酸模式（AAP）反映某蛋白在必需氨基酸的种类和含量上的区别，方法是将色氨酸的含量定为1，分别计算出其他必需氨基酸的相应比值[12]。对菜籽清蛋白进行氨基酸组成测定，其氨基酸种类及含量分析结果见表5。

表5 菜籽清蛋白的氨基酸组成与含量

从表5可知，菜籽清蛋白氨基酸种类齐全，含有18种氨基酸，总含量达73.19%，其中婴儿所需必需氨基酸组氨酸占2.61%，必需氨基酸含量占氨基酸总量（E/T）的38.10%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量比值（N/E）为0.62，均超过了 FAO/WHO标准推荐的36%和0.6，必需氨基酸模式接近WHO推荐人体蛋白需要模式，植物性蛋白往往缺少的精氨酸和蛋氨酸含量也很高，与谷物类蛋白一起可起到蛋白质的互补作用[13]，含量最高的Asp和Glu是构成人体血浆蛋白的重要成分。菜籽清蛋白中必需氨基酸组成均衡，有较好的营养价值，是一种有待开发食用的优质植物蛋白质。

3 结论

3.1 通过搅拌提取与超声波辅助浸提菜籽粕清蛋白的对比，选取较高提取率的超声辅助方法，根据响应曲面法中的Box－Behnken试验设计，对清蛋白提取的工艺条件进行优化，建立了以液料比、提取时间、超声温度、超声功率为因素的二次多项回归模型，方差分析表明方程拟合较好。对模型进行优化后，最优条件下实际提取率为8.53%，与理论预测值8.55%基本一致。

3.2 所制得菜籽清蛋白含18种氨基酸，且人体必需氨基酸种类齐全、组成平衡，是完全蛋白质，氨基酸总量为73.19 g/100 g，必需氨基酸占氨基酸总量的38.10%，并且必需氨基酸组成模式符合FAO/WHO推荐标准，富含功能性氨基酸，能弥补一些谷物类蛋白的部分氨基酸不足，是一种具有开发食用前景的植物蛋白资源。

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Ultrasound－Assisted Extraction and Amino Acid Composition of Napin from Rapeseed Meal

Zhao Bei Wang Chengming Zhang Shasha

（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070）

The optimization of ultrasound－assisted extraction for napin（rapeseed albumin）from defatted rapeseed meal has been determined with single factor experiments and response surface analysis.Effects of liquid/meal ratio，extraction time，ultrasonic temperature and ultrasonic power on napin extraction yield have been studied in the paper，and the amino acid composition（AAC）of obtained napin has also been analyzed.The optimal extraction conditions were liquid/meal ratio of 18 mL/g，extraction time of62 min，ultrasonic temperature of42℃ and ultrasonic power of 80 W.On the optimal conditions，the actual extraction rate of napin was8.53%.The results of AAC indicated that the napin was richly contained in all kinds of amino acids.The AAC of napin was balanceable and it complied with the FAO/WHO recommendation pattern.It could be judged that napin could be considered as a fine resource of vegetable protein.

napin（rapeseed albumin），ultrasound－assisted，optimization，amino acid composition

TQ432.2

A

1003－0174（2015）10－0032－05

2014－04－17

赵蓓，女，1989年出生，硕士，食品营养与安全

王承明，男，1964年出生，教授，食品品质控制及安全