利用分子标记辅助选择改良常规早稻鄂早18稻瘟病抗性

涂军明　游艾青　吕锐玲　周雷　曹志刚　张绍安　陈杰

摘要：以含广谱稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-2的GD-1为供体，常规早稻鄂早18为受体，通过杂交和回交并结合分子检测，将Pi-1和Pi-2基因聚合到鄂早18中，获得9个携带两个抗性基因的纯合改良株系。通过11个典型稻瘟病菌株进行混合接种鉴定，结果表明改良株系的稻瘟病的抗性大都达到中抗到抗的水平。通过对改良株系和对照鄂早18农艺性状考察，导入Pi-1和Pi-2两个基因对其主要农艺经济性状无显著影响。本研究为进一步选育出抗稻瘟病的早稻新品种积累了抗性亲本材料（Pi-1/Pi-2）和分子改良育种的经验。

关键词：分子标记辅助选择；Pi-1；Pi-2；稻瘟病；抗性改良

中图分类号：S511.032 文献标识码：B 文章编号：0439-8114（2015）22-5515-05

Abstract： The GD-1 containing two blast resistance genes Pi-1 and Pi-2 was used as gene donor to be crossed and then backcrossed with gene receptor Ezao 18 and through molecular detection， polymerizing genes Pi-1 and Pi-2 with Ezao 18， 9 homozygous improved strains with Pi-1 and Pi-2 were gathered. Through the mixed inoculation identification by using 11 typical rice blast strains， the results showed that the rice blast resistance of improved strains mostly were from medium resistant to resistant. Comparing the agronomic traits of improved strains and Ezao 18， the main agronomic traits have no significant difference after implanting genes Pi-1 and Pi-2. Through the identification， experiences of Parent material and improved molecular breeding were accumulated for further selecting and breeding new varieties of the early rice resistant to rice blast.

Key word： molecular marker-assisted selection； Pi-1； Pi-2； rice blast； resistance improvement

早稻大部分为籼稻，是中国的主要储备用粮，具有重要的战略意义。长江流域是中国主要的早稻生产区，常年早稻播种面积为533万hm2左右[1]，为维护国家粮食安全做出了突出贡献。近些年来，由于生产上应用的绝大部分早稻品种对稻瘟病缺乏抗性或抗性较差，如两优287、两优42、金优402等，加上近几年连续多年（7月）的高温阴雨天气，早稻稻瘟病的发生逐年加重，常常流行成灾，成为当前制约早稻生产的主要因子之一[2]。2009年湖北团风县相当一部分早稻暴发穗颈瘟和叶瘟而导致减产严重[3]。实践证明，培育与种植抗病品种是最经济有效的防治稻瘟病措施。选育抗稻瘟病的早稻品种也成为当前湖北省水稻育种工作者的主要育种目标之一。

近年来，随着分子生物学研究的不断发展，水稻基因图谱的日趋完善，植物育种已进入分子生物技术与传统常规技术有机结合的第三次突破阶段[4]。随着分子标记技术在抗稻瘟病育种中应用的不断加快，育种进程大大缩短，准确性和选择效率不断提高，不久的将来水稻育种取得的重大突破一定是在抗病育种方面。分子标记辅助选择（MAS，marker assisted-selection）是当前进行水稻抗病育种所广泛采用的行之有效的方法。目前，虽然对一些水稻材料通过MAS导入了抗稻瘟病基因也有报道，但早稻材料几乎未看到；省内育种同行专家在改良早籼型不育系9802S上也做了大量的工作，但距离生产上的大面积应用还需要一定时间。针对目前长江流域生产应用上的绝大部分早稻品种对稻瘟病缺乏抗性，本研究紧密结合水稻育种实践工作，选择生产上正在大面积应用的常规早籼稻鄂早18进行抗性改良，通过分子标记辅助选择和常规育种手段（杂交、回交、系统选择法等），同时导入目前已知的两个显性广谱高抗稻瘟病基因Pi-1（来源于西非利比亚粳稻品种LAC23）和Pi-2（哥伦比亚籼稻品种5173）[5，6]，并通过田间接种鉴定，筛选出田间表现中抗稻瘟病以上的中间材料，再通过选择得到较稳定的抗稻瘟病早稻材料，进一步选育出能够通过省级以上审定的抗稻瘟病的新品种或组合，以期为长江流域早稻生产提供抗病良种，为实现粮食增产和农民增收服务。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

含目标基因Pi-1、Pi-2的供体亲本GD-1由湖北省农业科学院粮食作物研究所游艾青老师提供，受体亲本为目前生产上大面积应用的常规早籼稻品种鄂早18[7]，种子由黄冈市农业科学院水稻研究所提供。

1.2 连锁标记及引物

研究表明，稻瘟病抗性基因 Pi-1定位在水稻第11号染色体上，Pi-2定位在水稻第6号染色体上。通过查阅文献和SSR标记筛选，本研究选取的与基因Pi-1紧密连锁的分子标记为RM5766（MRG4766）[8]，与基因Pi-2紧密连锁的分子标记为S29742[9]。引物序列由上海生物工程技术服务有限公司合成（表1）。endprint

1.3 分子检测

所有研究材料分别在湖北黄冈和海南陵水种植，采用简易SDS抽提法提取水稻幼嫩叶片DNA。PCR 扩增反应体系为15 μL，具体见表2。PCR 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火（根据不同的引物来设定具体温度，一般在 55～60 ℃之间）30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，全部过程完成后，扩增产物在4 ℃保存。在PCR扩增完成后的模板中加入少量的溴粉兰作指示剂，即可用于电泳。对于弱多态的引物，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，1.0～1.5 h拆板后用超纯水漂洗10 s，放入银染盆染色8 min，再用超纯水漂洗10 s，放入显色盆显色8 min，用超纯水漂洗10 s后晾干，最后读胶并照相保存。对于多态性较明显的引物可用1%左右的琼脂糖凝胶电泳，制胶后点样5～7 μL，电泳过程中，可用手提式紫外分析仪观察胶长，20～30 min后在凝胶成像仪下读胶并拍照保存[10，11]。

1.4 分子改良技术路线

2010年夏，在湖北黄冈以鄂早18为母本，与供体亲本GD-1杂交，得到F1代种子。2011年4月，在海南陵水以受体亲本为母本与F1代回交得到BC1F1种子。2011年夏在湖北黄冈对BC1F1单株分别进行分子标记检测，选择聚合2个不同抗性基因的单株，以受体亲本为母本进行回交得到BC2F1代种子。2012年春季在海南陵水回交得到BC3F1代种子。2012年夏在湖北黄冈选择聚合2个不同抗性基因杂合的单株继续回交，并在幼穗分化第五期进行注射接种鉴定，继续选择综合性状优良的抗稻瘟单株。2013年、2014年继续依次进行并选择综合性状优良的抗稻瘟单株[12]，技术路线如表3所示。

1.5 抗病性鉴定

主要采取人工接种鉴定，稻瘟病鉴定菌株为国家区试稻瘟病抗性鉴定的7种标准菌株：ZA、ZB、ZC、ZD、ZE、ZF、ZG[13]，由湖北省农业科学院植保土肥研究所提供原始菌样；再加上黄冈采集样品分离的稻瘟病菌株TF-1、TF-2（来自团风县发病点）和XS-1、XS-2（来自浠水县发病点），总共11个菌株。接种时把所有致病菌株均匀混合在一起注射接种。在水稻幼穗分化4～6期接种，接种部位为倒三叶叶腋下2～3 cm处，即水稻打苞时最凸起的位置，时间最好在阴雨天或16：00以后（25～27 ℃较好）。接种时事先配好混合病菌，利用5或10 mL的医用小针头注射器，将孢子悬浮液注入植株茎秆的中央空心部位，每株接种2 mL左右的菌液，接种时以看见心叶叶鞘顶端有水滴冒出为准。为确保能够发病和试验调查的准确，一般每个单株接种2～3个分蘖穗。每个分蘖穗接种后，在剑叶或者倒数第2片叶上系个结，做为标记，便于以后调查发病情况[14]。

1.6 农艺性状考察

2014年早季，利用导入了Pi-1与Pi-2基因的抗病株系与受体亲本材料（作对照）分别种植于黄冈市农业科学院基地，按随机区组设计，3次重复。常规水肥管理，成熟后取样考查株高、穗数、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重、生育期、产量等农艺性状。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

用幼嫩叶片提取DNA，再利用与2个抗性基因Pi-1及Pi-2连锁的分子标记对基因供体亲本GD-1与受体亲本鄂早18进行多态性分析。然后通过查阅文献，根据已经定位水稻染色体上的SSR标记，在对与Pi-1紧密连锁的SSR标记RM244、RM5766[8]和Pi-2标记AP22、RM527、RM3330、S29742[9]等筛选中，分别发现Pi-1标记RM5766、Pi-2标记S29742在供体亲本与受体亲本鄂早18间有明显多态性，说明利用RM5766、S29742分别对Pi-1和Pi-2基因进行分子标记辅助选择改良是完全可行的。

2.2 各世代的分子标记选择过程

2010年夏，用鄂早18与供体亲本GD-1杂交，得到杂交种102粒。2011年春季于海南用鄂早18作母本与杂种F1代回交。2011年夏在黄冈种植BC1F1共159株，分别利用SSR标记RM5766和S29742对 Pi-1和Pi-2 基因同时进行检测，筛选出双阳性植株27株。从中选择5株农艺性状优良且接近鄂早18的双阳性单株与鄂早18回交，得到种子210粒。2012年春季继续在海南种植BC2F1共110株，利用SSR标记进行选择，得到双阳性单株28株，对其中20株进行田间稻瘟病（穗颈瘟）接种鉴定，选择9株农艺性状优良、抗性较好且性状接近鄂早18的双阳性单株与鄂早18回交，得到种子245粒。2012年夏在黄冈种植BC3F1植株139株，分别利用SSR标记进行检测，得到BC3F1双阳性单株24株，并从中选择农艺性状优良且接近鄂早18的单株继续回交得到BC4F1种子216粒，并选取5株于2012年海南种植BC3F2。至2014年春季，分别得到农艺性状较一致且接近鄂早18的BC3F4单株4个、BC4F3单株5个。部分基因检测结果见表4和图1。

2.3 改良株系（单株）接种鉴定效果分析

由于穗颈瘟最常见，也往往对产量产生最直接和严重的影响，本研究将其作为抗性鉴定的重点。从回交世代开始，就进行人工接种（混合）鉴定，选择分子检测为双阳性单株且达到中抗以上水平的单株进行回交。2013年春季在海南育种基地，从幼穗分化第五期开始，分别对选择的BC3F4共4个株系和BC4F3共5个株系的双阳性株系群体进行穗颈稻瘟病抗性接种鉴定，接种结果见表5。由表5可知，受体亲本鄂早18表现为高感（HS），供体亲本GD-1表现为抗（R）；经过改良的株系，同时导入Pi-1和Pi-2两个抗病基因的植株，其对稻瘟病的抗性大都表现出中抗（MR）到抗的水平，说明累积这两个基因的株系对稻瘟病有较好的抗性，本研究也达到了稻瘟病抗性改良的目的。endprint

2.4 抗稻瘟病改良株系与受体亲本主要农艺性状的对比分析

2014年在湖北黄冈育种基地，以鄂早18作为对照，将选择的9个改良株系分3次重复，通过随机区组设计，考查株高、穗数、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重、产量、生育期等农艺性状，进行对比分析（表6）。由表6可知，9个改良株系与对照鄂早18在农艺性状和经济性状等方面没有明显差异，说明改良株系仍然保留了供体亲本材料的优良性状，导入Pi-1和Pi-2两个基因后对其杂种后代主要农艺经济性状无显著影响。改良株系在株高性状方面普遍矮于亲本，而生育期普遍要长于亲本，这可能在一定程度上受到供体亲本基因的影响。

3 小结与讨论

获得9个带有抗性基因Pi-1和Pi-2的纯合改良株系，比原始鄂早18稻瘟病抗性大幅度提高；改良株系保留了供体亲本材料的优良性状，导入Pi-1和Pi-2两个基因后对其主要农艺经济性状无显著影响。本研究为培育出抗稻瘟病的早稻亲本材料（Pi-1/Pi-2）及早稻新品种奠定了坚实的基础。

3.1 关于分子标记辅助选择在水稻抗稻瘟病育种中的应用

利用分子辅助选择进行抗性改良已经成为目前水稻育种最常用的手段之一，但分子标记技术不是万能的，要想获得良好的持久抗性，需要利用多途径、多手段以及传统育种方法进行全面选择，最终形成品种到大田应用，还需育种家进行规范化的品种筛选和严格的试验示范工作[15，16]。当前，随着分子标记辅助选择各项技术研究的不断深入，水稻抗稻瘟病改良近几年来也取得一些成绩，广东省农业科学院水稻研究所就利用分子标记辅助选择相继选育出一些抗性较好的不育系、恢复系材料和品种组合，自2010年以来湖北省区试中也陆续出现一些利用分子育种技术选育的稻瘟病抗性较好的新品种，但对于如何能够选育出综合性状都十分优良的大面积推广应用的抗稻瘟病品种，还存在许多现实的问题，如抗性、高产和米质以及其他优良性状如何有机融合的问题、稻瘟病生理小种不断变化的问题、抗病性的鉴定问题等，但是有理由相信，随着分子标记技术研究不断进步和新抗性基因的精细定位，以及抗病检测手段的不断创新，利用分子辅助选择进行抗稻瘟病育种必将翻开新篇章[17-19]。

3.2 选择合适的稻瘟病抗性鉴定方法

利用分子标记辅助选择只是进行抗性改良的第一步，由于不同品种遗传背景的不同以及稻瘟病生理小种的多样性，要达到良好的抗性效果必须结合田间稻瘟病抗性接种鉴定。对稻瘟病的接种鉴定国家很早就制定了相应的鉴定标准和鉴定方法，目前在实践工作中最广泛应用的主要有两种，一种是对叶瘟的喷雾接种和对穗颈瘟的注射接种，主要是人工操作；另一种是在常年自然发病地区的小气候条件下，通过种植诱发品种进行自然接种鉴定[20]。这两种方法各有利弊。人工接种鉴定方法可以同时对多个稻瘟病菌株进行接种，还可以采集培养当地生理小种菌株进行有针对性的接种，且环境条件、发病因素可控性较强，接种的单株发病一般都较为理想，但劣势是对试验条件要求高、工作量较大，菌株培养费时费力，致病菌株种类少、过程短，群体发病不理想。自然诱发鉴定的操作过程相对简单，通过诱发品种的感染，供试植株在自然条件下自然发病，稻瘟病菌株生理小种种类多、致病过程长，可全生育期覆盖，群体发病较理想，但劣势是发病条件不可控，有的年份发病好，有的年份发病不理想，有的植株或群体发病，有的不发病但不表示一定抗病，偶然性较大。如何提高抗稻瘟病接种鉴定的准确性是进行抗稻瘟病改良育种的关键因素。

因为操作过程相对要简单得多，很多研究者采用的是在苗期对叶瘟进行接种鉴定，且很多研究证明了导入抗性基因的植株对叶瘟抗性也较好。但目前还没有相关研究能够清楚地证明叶瘟与穗颈瘟有一定的对应关系，且近几年穗颈瘟在实际大田生产中发病越来越重、危害也越来越大，而叶瘟危害相对较小。因此，本试验以人工接种穗颈瘟鉴定为主，每年在湖北黄冈当地和海南基地对试验材料进行人工接种两次，每次发病情况都有一定不同。总体来看，人工注射接种时海南基地效果要比湖北黄冈当地接种效果要好，而且在不同气候条件接种时效果差异很大。究其原因，发现温度成为主要发病限制因子，接种当天至次日最高温度低于27 ℃（高于22 ℃）时效果一般较好，阴雨天比晴天接种效果要好。在海南2月中下旬气温常年在20～26 ℃，注射接种效果一般都很好；在湖北黄冈当地6月份阴雨天接种时效果也很好。对叶瘟的喷雾接种由于试验过程相对简单，易于操作，效果一般都较好。在进行抗稻瘟病育种时，将喷雾接种和注射接种有机结合起来，选择合适的气候条件进行人工接种鉴定，对开展稻瘟病全生育期抗性育种会有很大的辅助作用[21]。

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（责任编辑 韩 雪）endprint