猪MBF1基因的克隆与序列分析

武华玉　程碧军　乔木　黄京书　刘贵生　彭先文　李良华　吴俊静　梅书棋

摘要：克隆了MBF1基因875 bp的cDNA序列和1 919 bp的基因全序列（登录号：EF 625885）。序列分析表明，猪MBF1基因序列与人、小鼠的相似性分别为89%和88%，氨基酸序列与人和小鼠的相似性分别为99%和97%，猪MBF1基因包含5个外显子和4个内含子，内含子的剪接方式都符合“GT-AG”法则；组织表达谱分析表明MBF1基因在心、肝、脾、肾、子宫中表达量较高，在胃和小肠中低表达。

关键词：猪；MBF1基因；克隆；序列分析

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）22-5748-03

Abstract： In this study， 875 bp mRNA sequence and 1 919 bp genomic sequence （EF 625885）of porcine MBF1 gene （multiprotein bridging factor 1） were cloned. A multiple alignment of MBF1 sequences showed that porcine MBF1 sequence had 89% identity with that of human， 88% identity with that of mouse， Amino acid sequence analysis showed that MBF1 had 99% identity with that of human， 97% identity with that of mouse. Sequence analysis revealed that porcine MBF1 gene consists of 5 exons and 4 introns and the locations of splice donor/acceptor sites in all introns conform to “GT/AG” rule. RT-PCR analysis showed that MBF1 gene was highly expressed in heart， liver， spleen， kidney， uterus， and lowly expressed in stomach and small intestine.

Key words： porcine； MBF1 gene； clone； sequence analysis

多蛋白橋梁因子（Multiprotein bridging factor 1， MBF1）是一种核受体辅激活因子，其通过桥连通用转录因子TBP和基因特异性转录因子，增强特异性转录因子的DNA结合活性和结合靶基因的启动子活性，介导靶基因的转录激活，调节生物体的各种生命活动[1-3]。MBF1是一个高度保守的调节内皮细胞分化、中枢神经系统发育、脂类和组氨酸新陈代谢的转录辅激活蛋白[4，5]。人类MBF1结合TBP在类固醇激素生成中起重要调节作用，调节类固醇激素的生成[6]。MBF1还可以增强一些与脂类代谢相关的核受体转录激活，调节核受体的活性以调节脂质的动态平衡[4]。本研究克隆了猪MBF1基因，研究其表达模式，为进一步研究MBF1对猪生长发育调控的分子遗传机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集4月龄大白猪（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场）、梅山猪（英山县绿源养猪专业合作社）的肌肉组织，液氮速冻后置于-70 ℃冰箱中，利用Trizol提取总RNA，利用DNA提取试剂盒提取DNA，-20 ℃贮存备用。

1.2 主要试剂及引物

pMD-18T vector system、DH5α购自宝生物工程（大连）有限公司；Gel Extraction Kit购自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成，去离子水溶解，-20 ℃保存。

以人类MBF1基因序列为探针，利用NCBI中BLAST工具在GenBank数据库中搜索同源序列，筛选猪的同源性EST序列（长度≥200 bp，相似性≥80%），用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序列拼接，参照拼接的Contig采用Primer 5.0软件设计引物M1F/M1R、M2F/M2R两对引物扩增MBF1基因的cDNA序列，参照MBF1基因的cDNA序列设计M3F/M3R、M4F/M4R两对引物扩增MBF1基因的全序列，采用引物M3F/M3R进行基因表达谱分析（表1）。

1.3 PCR扩增与克隆

PCR扩增体系为25 μL，体系中各组分的浓度为50 ng 模板DNA（cDNA）、2×PCR mix、0.5 mmol/L PCR primers。PCR扩增程序为： 94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性 45 s，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s， 35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带用Gel Extraction Kit 试剂盒纯化回收，回收后的PCR产物与pMD-18T vector system连接，转化大肠杆菌DH5α，并将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序。

1.4 组织表达谱分析

提取4月龄大白猪肝、心、肾、脂肪、肌肉、胃、小肠、肺、脾、子宫、卵巢11个组织的RNA反转录为cDNA，以猪管家基因GAPDH （6-磷酸甘油醛脱氢酶）为内参基因，引物为GAPDHF/GAPDHR（表1）。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s， 58 ℃退火50 s， 72 ℃延伸40 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增结果

利用引物M1F、M1R，M2F/M2R扩增出大白猪MBF1基因序列，将PCR产物回收纯化克隆测序，测序结果表明，引物M1F/M1R扩增片断长度为617 bp，引物M2F/M2R扩增片断长度为274 bp（图1）。

2.2 猪MBF1基因cDNA序列分析

利用DNAStar软件的SeqMan程序将RT-PCR扩增得到的片段进行拼接，得到一条长875 bp的cDNA序列，将获得的猪cDNA序列分别与人MBF1基因cDNA序列（GenBank登录号： NM_003792）和小鼠序列（GenBank登录号：NM_021519）进行比对。结果表明，猪MBF1基因与人、小鼠的相似性分别为89%和88%，确定所获取的序列为猪的MBF1基因，含有一个447 bp的开放阅读框。

2.3 猪MBF1蛋白与部分物种MBF1的进化关系

利用GenBank已有的MBF1蛋白质序列：NP_003787（MBF1，Huamn）、NP_067494（MBF1，Mouse）、

NP_001006203（MBF1，Gallus）、NP_001016686（MBF1，

Xenopus tropicalis）、NP_957039（MBF1，Zebrafish）以及预测的猪MBF1基因编码氨基酸，利用ClustalW软件对6个物种的USF1蛋白进行了序列比对。结果表明，猪编码的氨基酸序列与人、小鼠、鸡、非洲爪蟾、斑马鱼的相似性分别为99%、97%、92%、88%、82%，并构建了系统进化树（图2）。

2.4 猪MBF1基因全序列的克隆与序列分析

根据人类MBF1基因全序列，参照分离得到的猪MBF1基因序列，设计M3F/M3R、M4F/M4R两对引物，以大白猪基因组DNA为模板扩增猪MBF1基因的内含子序列，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图3。

对PCR扩增产物进行测序，结果表明，引物M3F/M3R在猪基因组中的扩增片断长度是753 bp，其中第2内含子的长度为355 bp， 第3内含子的长度为197 bp；引物M4F/M4R在猪基因组中的扩增片断长度579 bp，其中第4内含子的长度为492 bp。将序列拼接获得的1 919 bp的猪MBF1基因组序列，提交到GenBank收录号为EF 625885；通过内含子、外显子、边界分析发现猪MBF1基因的内含子的剪接方式都符合“GT-AG”法则（图4）。

2.5 猪MBF1基因的组织表达谱分析

利用特异引物M3F/M3R，并将GAPDH作为对照，以各个组织cDNA為模板进行半定量RT-PCR扩增，扩增产物长度分别为261 bp和480 bp（图5）。结果表明，MBF1基因在心、肝、脾、肾、子宫中表达量较高，在肺、胃、脂肪、脂肪、肌肉、卵巢中等表达，在胃和小肠中表达量较低。

3 小结与讨论

本研究结果表明猪MBF1基因的cDNA序列与人和小鼠序列的相似性分别为89%和88%，MBF1基因编码的蛋白质序列与人和小鼠的蛋白质序列相似性分别为99%和97%。编码区的高度保守性和蛋白质序列的高度相似性证实了所分离基因的正确性，同时也为利用人、小鼠等模式动物的基因信息来进行畜禽基因组学的研究提供依据。

动物间的基因结构具有高度的保守性，根据已知物种的基因组结构，可以预测其他物种同源基因的结构。本研究利用人MBF1基因结构，预测了猪MBF1基因结构，并通过试验的方法获得了相应的基因组序列，所获得的候选基因的内含子和外显子组成及相对位置与预测结果一致，且内含子的剪切方式均符合“GT-AG”法则。本研究分离的MBF1基因与人相应的基因具有相同的基因组结构，这也印证了基因组结构在不同物种间的高度保守性，同时也说明根据已知物种基因组结构来预测其他物种同源基因结构的可行性。

参考文献：

[1] TAKEMARU K， LI F Q， UEDA H， et al. Multiprotein bridging factor 1（MBF1） is an evolutionarily conserved transcriptional coactivator that connects regulatory factor and TATA element-binding protein[J]. Proc Natl Acad Sci，1997，94：7251-7256.

[2] TAKEMARU K， HARASHIMA S， UEDA H， et al. Yeast coactivator MBF1 mediates GCN4-dependent transcriptional activation [J]. Mol Cell Bio，1998，18：4971-4976.

[3] OZAKI J， TAKEMARU K， IKEGAMI T， et al. Identification of the core domain and the secondary structure of the transcriptional coactivator MBF1[J]. Genes Cells，1999，4：415-424.

[4] BRENDEL C， GELMAN L， AUWERX J. Multiprotein bridging factor 1（MBF1） is coactivator for nuclear receptors that regulate lipid metabolism[J]. Mol Endocrinol，2002，16：1367-1377.

[5] LIU Q X， JINDRA M，UEDA H，et al. Drosophila MBF1 is coactivator for tracheae defective and contributes to the formation of tracheal and nervous system[J]. Development，2003， 130：729-728.

[6] KABE Y， GOTO M， SHIMA D， et al. The role of human MBF1 as a transcriptional coactivator[J]. J Bio Chem，1999， 274：34196-34202.