高温状态影响实验小鼠精液质量的研究与分析

高温状态影响实验小鼠精液质量的研究与分析

陈杰翔李利①

(泸州医学院附属医院泌尿外科四川泸州646000；①护理部)

[摘要]①目的探讨在不同高温状态下小鼠精液质量的变化，为研究高温状态影响人类生育能力的机制提供动物实验依据。②方法将125只健康雄性成年昆明小鼠随机分为5组，每组25只。对照组给予22℃恒温饲养，高温组下设31℃、34℃、37℃、40℃4个组，分别于实验开始的第1、3、5、7、9天，每组随机抽取5只小鼠，测定精子DNA及精子顶体完整率的变化情况。③结果与对照组相比，各高温组实验小鼠的精液质量均明显异常，且温度越高，精液质量下降越快，差异具有统计学意义(P<0.01)；随着高温持续时间的延长，各高温组实验小鼠的精液质量呈现不同程度的异常，差异具有统计学意义(P<0.01)。④结论高温可能通过影响雄性小鼠精子DNA损伤及附属性腺的功能，导致精子DNA及精子顶体完整率出现不同程度的异常，从而影响其生育能力。

[关键词]高温精液分析精子DNA精子顶体完整率

[中图分类号]Q 33

【作者简介】陈杰翔(1976-)，副教授，主要研究方向：泌尿生殖外科。

Research and analysis of high temperature state affect on semen quality laboratory miceCHENJiexiang,LILi(DepartmentofUrology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,SichuanLuzhou646000,China)

ABSTRACT[]ObjectiveIn this study,adult male mice of different experimental animal models constructed under high temperature,measured changes in sperm DNA integrity and sperm acrosome integrity rate，and to explore the state under different temperature changes in semen quality in mice for the study of effects of high temperature mechanism to provide human fertility based on animal experiments.MethodsThe 125 healthy adult male mice were randomly divided into 5 groups，each group 25 mice，in which the control group to be 22℃ thermostat feeding，the group consists of high temperature 31℃、34℃、37℃、40℃ four groups，respectively，in the first days of the experiment began 1、3、5、7、9 randomly selected five mice per group measured changes in sperm DNA integrityand and acrosome integrity rate.Resultscompared with the control group,the semen quality of the high-temperature experiments in mice were significantly abnormal，and the higher the temperature，the faster the decline in semen quality，the difference was statistically significant (P<0.01)；With the high temperature duration the extended semen quality of the high-temperature experiments in mice showed varying degrees of abnormality，the difference was statistically significant (P<0.01).ConclusionHigh temperature may influence male sperm DNA damage and its subsidiaries gonadal function，leading to sperm DNA integrity and sperm acrosome integrity rate varying degrees of abnormality，thus affecting their fertility.

[KEYWORDS]High temperature.Semen analysis.Sperm DNA integrity.Acrosome integrity rate

由于环境污染、生活饮食方式的改变以及环境温度变化等，人类精液质量呈现下降趋势[1]。早期研究表明，高温环境能诱导正常细胞的凋亡，但是否影响男性生殖功能及其确切机制目前还不十分明确。本研究以成年雄性昆明小鼠构建不同高温状态下的实验动物模型，测定精子DNA及精子顶体完整率的变化情况，探讨在不同高温状态下小鼠精液质量的变化,研究高温状态与小鼠精液质量的相关性，从而为进一步探讨高温影响人类生育能力的机制提供动物实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物成年健康雄性昆明小鼠125只，体质量25～30g，6～8周龄(由吉林大学基础医学部实验动物中心提供)。适应性喂养1周后开始试验。实验过程中，实验小鼠均自由采食、饮水、活动，日照时间12h。将125只小鼠随机分为5组，每组25只。利用智能光照培养箱模拟不同的高温环境，其中对照组给予22℃恒温饲养，高温组下设31℃、34℃、37℃、40℃4组，分别于实验开始的第1、3、5、7、9d随机抽取5只小鼠,测定每组精子DNA损伤情况及精子顶体完整率的变化情况。

1.2精子顶体完整率检测采用颈椎脱臼法将实验小鼠处死，取两侧附睾尾部组织0.02 g，置2.0mL Ca2+浓度为1.3mmol/L的TYH培养液中剪碎，37℃、CO2孵箱温育10min，使精子游离，加TYH液至4mL，调整精子浓度至(3～6)×106/mL，待检。取处理过的精液1mL，置37℃、CO2孵箱温育5h，使其获能；1000r/min，离心3min，弃上清，沉淀以5%甲醛溶液固定10min，混匀，吸取50μL精子悬液滴于载玻片上涂片晾干，用0.22%考马斯亮兰G250染液浸染至少30min，蒸馏水冲洗，晾干。400倍显微镜下完整视野计数200条精子进行精子顶体完整率分类。精子顶体完整率根据顶体的外形和损伤情况，将精子顶体分为4种类型，并计算顶体完整率。I型：顶体完整，精子外形正常，着色均匀，顶体边缘整齐，有时可见清晰的赤道板；II型：顶体轻微膨胀，精子质膜(顶体膜)疏松膨大；Ⅲ型：顶体破坏，精子质膜严重膨胀受损，着色浅，边缘不整齐；Ⅳ型：顶体全部脱落，精子核裸露。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型均为顶体不完整。顶体完整率(%)的计算：顶体完整率=(顶体完整精子数/精子总数)×100%。顶体完整率大于75%为正常值。同一份精液样本由2位专业检测人员依据世界卫生组织(WHO)2010精液分析标准进行分析。

1.3染色体结构分析(sperm chromosome structure analysis，SCSA)测定精子DNA完整性采用颈椎脱臼法将实验小鼠处死，取各组实验小鼠右侧附睾组织制备精子悬液，40μL精子悬液中加入160μL TNE buffer(0.01mol/L Tris-cl，0.15mol/L NaCl，1mmol/L disodium EDTA，pH7.4) ，稀释精子悬液至体积为200μL，密度1～2×106/mL，立刻加入400μL酸处理液(0.08mol/L HCl，0.15mol/L NaCl，0.1% W/V Triton，pH1.2)振荡混匀，30s后加入1.2mL AO染液(6g/mL AO溶于0.037mol/L Citric-acid，0.12mol/L Na2HPO4，1.1mmol/L Disodium EDTA，0.15mol/L NaCl，pH6.0)30min。标本用荧光显微镜(520nm激发光)观察精子，用流式细胞液测定精子DNA片段化指数(DFI)。计数每只动物200个精子中绿色、红色和橙黄色精子数。其中绿色为DNA双链精子、红色为DNA单链、橙黄色为DNA双链不稳定精子。计算出红色、橙黄色荧光精子的百分率，即为精子DNA碎片化指数(DNA fragmentation index，DFI)，精子DNA完整性=1-DFI。

2结果

不同高温组实验小鼠精子DNA损伤及精子顶体完整率的变化情况,见表1，表2。

表1　对照组与各高温组实验小鼠DFI检测结果比较(%, ±s)

注：同一时间点内，与对照组比较,*P<0.01；与31℃比较,#P<0.01；与34℃比较,■P<0.01；与37℃比较,▲P<0.01；同一实验组内，与第1d比较,￥P<0.01；与第3d比较,￥P<0.01；与第5d比较,￥P<0.01；与第7d比较,￥P<0.01表2　对照组与各高温组实验小鼠精子顶体完整率检测结果比较(%, ±s)

注：同一时间点内，与对照组比较,*P<0.01；与31℃比较,#P<0.01；与34℃比较,■P<0.01；与37℃比较,▲P<0.01；同一实验组内，与第1d比较,￥P<0.01；与第3d比较,￥P<0.01；与第5d比较,￥P<0.01；与第7d比较,￥P<0.01

综上可见，与对照组相比，各高温组实验小鼠的精液质量均明显异常，且温度越高，精液质量下降越快，差异具有统计学意义(P<0.01)；随着高温持续时间的延长，各高温组实验小鼠的精液质量呈现不同程度的异常，差异具有统计学意义(P<0.01)。

3讨论

过去的数十年中，全球的平均温度升高了大约0.5℃，并且据预测将以更快的速度持续升高[2]。环境温度的变化将对哺乳动物的精液质量产生一定程度的影响[3]。哺乳动物的精子成熟过程较为复杂，其中包括睾丸内精子的产生以及附睾内精子的成熟，其适宜的温度通常要比体温低5℃~7℃。由于阴囊具有一定的温度调节作用，从而使得睾丸内始终保持精子产生的适宜温度环境，但是这种调节能力具有一定的范围，当外界的温度环境过高，超过了阴囊的调温能力时，就会导致阴囊内睾丸温度过高，影响精子的发生[4]；另外由于附睾同时位于阴囊内，当环境温度超过阴囊的调节能力时，附睾内精子的成熟也会受到影响，从而影响精子的受精能力和运动能力[5]。

精子顶体是精子细胞特有的结构，其正常功能对精子受精能力起决定性的作用。精子顶体位于精子头前端，覆盖在精子核前面，由顶体帽与赤道板组成，是一个膜结合的帽状结构。顶体内含有多种蛋白水解酶和磷酸酯酶，在顶体反应时，这些酶释放或暴露出来。帮助精子穿过卵细胞表面透明带和放射冠，与其结合形成受精卵，从而完成受精。顶体完整率是反映顶体缺陷与否的重要指标。检测顶体完整率有助于提示精子的受精能力，因此可通过检测精子顶体完整率来判断精子获能及潜在生育能力的状况。完整顶体的活力精子呈酸性，可被嗜酸性探针L-Tracker特异性标记，呈绿色荧光。顶体不完整常有以下情况：顶体缺乏、顶体薄、体积小、泡状顶体、无内容物或电子密度降低等。这些类型的精子顶体酶缺失或活性降低，使精子不能穿越卵细胞的放射冠和透明带，导致受精率降低[6]。目前已经发明的精子数字成像系统可以客观地对精子核形态进行评价，自动化的精子头部形态测量系统不仅可以对精子头部长度、宽度、面积等参数进行测量，还可以对这些数据的改变，如精子头部的宽度与长度以及精子的周长等指标进行计算，从而把精子分为生育组精子和不能生育组精子。精子顶体的缺陷与男性不育有密切关系，若将顶体形态分析作为精子形态学分析的诊断指标之一，将对男性不育症的实验诊断及临床疗效评估提供良好的应用价值，可作为精子形态学及功能检查的常规项目推广应用，为男性不育症治疗提供实验依据[7]。

精子染色质结构分析法(SCSA)由Evenson等提出[8]：用热或酸处理已液化的精子，由于受损伤和未成熟精子的鱼精蛋白巯基未发生氧化，染色质结构松散，DNA在酸的作用下易变性成单链。吖啶橙是一种荧光络黄染料，具有高度的异染性，以插入的方式与双螺旋的DNA 分子结合，应用吖啶橙染液的异染性可对损伤和正常的精子DNA进行区分，以评估精子DNA的完整性。染色后断裂的精子单链DNA在荧光显微镜下呈红色荧光，而正常精子双链DNA呈绿色荧光，其结果通过流式细胞仪检测。此外，SCSA分析所获另一项指标-高DNA可染性(HDS)代表了呈强绿色荧光的精子百分率，可作为反映精子成熟度的指标。SCSA参数反映了不同精子染色质构象的异质性，操作快速简便，结果直观可靠，可定量检测，便于标准化，是临床最常用的DNA完整性检测方法[9]。细胞核DNA是精子的主要遗传物质，其完整性是遗传物质正确传递给子代的前提，对于子代的繁衍具有重要意义，在受精和胚胎发育中发挥重要作用。在人类精子发生过程中，染色质的DNA结合蛋白主要为鱼精蛋白，其在分子内外能够形成二硫键交联，具有保护精子DNA完整性，使DNA免受损伤的作用。但是，在正常和不育男性精液中，均存在一定程度的精子DNA损伤。有研究报道,精子DNA损伤会对自然生育和辅助生殖技术治疗结果产生负面影响，并与复发性流产相关。自然受孕过程中，DNA受损的精子几乎不可能与卵子成功结合并完成受精。研究表明，DNA损伤程度与自然受孕率呈显著负相关，如果男性精子DNA损伤率>30% ，则自然生育的可能性几乎为0[10]。精子DNA损伤的机制尚不明确，可能是多种因素共同作用的结果。例如：精子发生过程中染色质组装异常，精子在发生及生殖道转运过程中遭受毒物和氧化应激的损伤以及精子细胞异常凋亡等。精子DNA损伤分析是比传统精液常规分析参数更稳定、更敏感地预测男性生育能力的指标。精子DNA完整度分析区别不育和生育能力正常的特异度为89.4%，敏感度为96.9%，这提示精子染色质或DNA完整性可能是精子质量的独立预测指标，作为精子质量临床评价标准具有优越的可行性[11]。

高温诱发生精细胞凋亡的机制十分复杂，不仅涉及温度过高直接导致阴囊、睾丸的热调节能力失效，睾丸内温度升高，使得睾丸内生精细胞浆膜及细胞结构的改变，导致细胞内外各种信号的传导异常及代谢障碍；同时可能导致细胞内各种细胞的损伤及细胞间信息物质的变化，这些改变均可能使得生精细胞凋亡从而引起生精功能障碍。高温环境下温度一方面直接作用于睾丸，造成睾丸内微环境、代谢和生化情况的改变，使生精细胞退化变性、脱落、凋亡增加，精子产生受到抑制，精子质量和活动能力下降;另一方面直接或间接地作用于附属性腺如附睾等，使精子失去成熟的机会[11]，从而进一步影响精子的受精能力，导致不育的发生。

参考文献

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(2015-05-25收稿)(王一伊编辑)

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