柿叶总黄酮的分离及对油脂抗氧化的研究

林国荣 罗素丽

（莆田学院环境与生物工程学院，莆田 351100）

柿叶总黄酮的分离及对油脂抗氧化的研究

林国荣 罗素丽

（莆田学院环境与生物工程学院，莆田 351100）

以柿叶粗提物为原料，采用HZ816型大孔吸附树脂分离纯化柿叶的黄酮类化合物。大孔树脂HZ816纯化柿叶黄酮的适宜工艺参数为：常温流速2 BV上柱吸附，上样质量浓度5.229mg／mL，pH为3.10，洗脱流速为3 BV／h，乙醇体积分数为50%洗脱。柿叶黄酮抗氧化试验表明柿叶黄酮类化合物可有效延缓油脂脂质过氧化反应，其抗氧化性明显优于抗坏血酸，表明柿叶黄酮类化合物是一种很有潜力的天然、安全、高效的抗氧化剂。

柿叶 黄酮类化合物 分离 大孔树脂 抗氧化

柿属植物有柿（Diospyros KakiLinn）、君迁子（D．lotusLion）、油柿（D．oleiefraCherg）等，但以柿（DiospyroskkaiL．f）最常见。柿叶，为柿属（DiospyrosL.）植物柿（Diospyros kaki L．f或persimmon）的叶片，味苦、性寒，其入药始载于明《滇南本草》曰“经霜叶敷臃疮”［1］。

研究表明，柿叶中含有丰富的维生素，芦丁以及铁，锌，钙等对人体健康有益的非药性营养成分，柿叶具有清热解毒、改善血管的通透性等多种医疗保健功能［2］。柿叶的主要有效成分——黄酮类化合物，具有抗癌、抗氧化、抗菌等生理活性，柿叶黄酮具有明显的抗氧化作用，在食品工业上可用作抗氧化剂等，在一定使用量条件下可与茶多酚、橙皮甙这些新型的天然抗氧化物质相媲美［3］。随着柿子叶的利用价值不断的被挖掘，市场上不断的利用柿叶加工制成了柿叶茶、柿叶奶茶、柿叶饮料等保健品，但是有关柿叶的有效成分的分离及其在食品工业上应用研究较少。油脂容易被氧化而影响食品质量，而植物中黄酮类化合物良好的天然抗氧化性引起了人们高度重视，基于此，本研究以油脂的过氧化值（POV值）为考察指标，采用烘箱法测定了柿叶总黄酮对动植物油的抗氧化效果，以期为柿叶功能产品的开发和综合利用，提高柿叶的经济附加值提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

柿叶：柿树科（Ebenaceae）柿树属（Persimmonl）柿树，新鲜叶子经干燥碾碎后备用；天然大豆油：市售；纯猪油：自制。

1.2 主要化学试剂与仪器

芦丁：中国生物制品有限公司；大孔吸附树脂：HZ－801、HZ－816、D－101、HPD－100、AB－8、NKA－9等；低压玻璃层析柱（Φ1.0 cm×20 cm）、DBS－100自动分部收集器；上海沪西分析仪器厂有限公司；BT－100蠕动泵：保定兰格衡流泵有限公司；旋转蒸发仪（EYELA N－1000旋转蒸发器，EYELA SB－1000数显水浴锅）：EYELA公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

芦丁标准液的配制：精密称取干燥至恒重的芦丁标准品0.010 0 g，加50%的乙醇溶解，装入50 mL容量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得0.20mg／mL的芦丁标准溶液。

标准曲线的制作：分别量取芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL于10 mL的容量瓶中，摇匀，备用。准确吸取1.0 mL稀释后的芦丁溶液，加入1%三氯化铝溶液，摇匀。加入2.0 mL水，摇匀，放置10 min，参比对照时，将稀释后的芦丁溶液换成水作为参比，在波长420 nm处测定各自的吸光度［4］。芦丁浓度与吸光度线性关系良好，线性回归方程为：C＝0．933A－0.004 8（R2＝0.999 1），式中：C为黄酮质量浓度／（mg／mL）；A为吸光值。

1.3.2 柿叶黄酮物质的提取

称取100.0 g的柿叶，采用水提，固液比1∶10，温度70℃，提取时间2 h，提取后过滤，备用。所得提取液黄酮质量浓度为4.92mg／mL，提取量35.15mg／g。

1.3.3 柿叶黄酮的分离纯化

研究表明，大孔树脂吸附法是一种比较适合黄酮类物质纯化的方法，大孔树脂对柿叶中总黄酮进行分离纯化，工艺简单可行［5－7］。本试验考察了HZ－801、HZ806、HZ－816、D－101、HPD－100、AB－8、NKA－9 7种大孔树脂对柿叶黄酮的吸附和洗脱能力，选出最适的大孔吸附树脂。

1.3.3.1 大孔树脂静态筛选

分别量取5.0 mL处理好的HZ801、HZ806、HZ816、D101、HP100、AB－8、NKA－9大孔吸附树脂［8］，装入250 mL的三角瓶中，分别加入50.0 mL柿叶提取液，用保鲜膜封口，置于恒温振荡器中振荡，震荡6 h充分吸附后，测定吸附后的液体OD420nm值，然后将各瓶中混合液进行过滤，去除吸附后的液体，加入体积分数为50%的乙醇50.0 mL，封口置振荡器中振荡2 h，测定各树脂解吸液中的OD420nm值，计算出其吸附率和洗脱率，选出分离纯化柿叶黄酮最佳的大孔吸附树脂［9］。

1.3.3.2 HZ816树脂对柿叶黄酮的分离工艺考察

量取15 mL处理好HZ816大孔吸附树脂，湿法装柱。每次量取300 mL一定pH的柿叶黄酮提取液上柱，控制一定的流速，用分部收集器收集流出液。通过改变上样液流速（2、3、4 BV／h）；上样液质量浓度（5.229、6.694、9.530mg／mL）和上样液pH（3.1、4.5、6.0）的试验，确定其最适上样流速，上样液浓度和pH。

按相同上样条件进行吸附，通过改变洗脱流速（2、3、4 BV／h）和乙醇体积分数（40%、50%、60%）的试验，考察其最适洗脱流速和洗脱剂浓度。

1.3.4 柿叶黄酮对油脂抗氧化试验

精确称取2～3 g混匀的试样于250 mL锥形瓶中，记录其质量。在各锥形瓶中分别加入30 mL三氯甲烷－冰乙酸混合液，再加入1 mL饱和碘化钾溶液，立即用保鲜膜封住瓶口，轻轻振荡，置于暗处3 min。然后加水100 mL，振荡后立即用0.002 mol／L硫代硫酸钠标准溶液滴定，至淡黄色时，加入1 mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点。按照上述方法进行空白对照滴定［10］。

过氧化值POV＝（V1－V2）×C×1 000／2×m

式中：V1为试样消耗硫代硫酸钠标准溶液体积／mL；V2为空白试验消耗硫代硫酸钠标准溶液体积／mL；C为硫代硫酸钠标准溶液的浓度／mol／L；m为试样的质量／g。

1.3.4.1 柿叶黄酮对动物油脂抗氧化试验

在小烧杯中分别加入用少量的无水乙醇溶解不同用量的柿叶黄酮（4、8、12mg）和4.0mg的抗坏血酸（作为阳性对照），然后各自加入40 g猪油，搅拌均匀，放入（60±1）℃恒温箱中保存，每隔一定时间测定其过氧化值（POV，mmol／kg）［11］，以此表示油脂的氧化速度，比较不同浓度黄酮对动物油脂抗氧化作用。

1.3.4.2 柿叶黄酮对植物油抗氧化试验

在小烧杯中分别加入用少量的无水乙醇溶解后不同用量的柿叶黄酮（0.5、1.0、1.5、2.0mg）和2.0mg的抗坏血酸（作为阳性对照），然后各自加入50 mL大豆油，搅拌均匀，放入（60±1）℃恒温箱中保存，每隔一定时间取样测定大豆油的POV值。

2 结果与分析

2.1 柿叶黄酮分离纯化工艺的确定

2.1.1 柿叶黄酮富集纯化大孔树脂的确定

大孔树脂的吸附性能对黄酮的纯化影响很大，树脂的极性和空间结构（主要指孔径、比表面积及孔容等）是影响吸附性能的重要因素。试验所用样品液黄酮含量5.0mg／mL，结果如表1。

表1 不同大孔树脂对柿叶黄酮吸附率及洗脱率的比较／%

从表1可以看出，HZ816型树脂对柿叶黄酮类化合物的分离富集效果较其他6种树脂好，且容易洗脱，得到的黄酮类化合物的回收率也较高。故选择HZ816大孔吸附树脂作为柿叶黄酮的富集纯化的介质。

2.1.2 吸附流速对HZ816树脂吸附柿叶黄酮的影响

不同吸附流速下黄酮吸附曲线见图1。图1曲线说明在各种流速下黄酮的浓度值都随着上样量的递增而增加。刚开始树脂的吸附量最大，然后慢慢下降直至树脂饱和，曲线趋于平衡。随着上样流速的增加，吸附率越来越小，流速影响溶质向树脂表面扩散，决定了吸附效果。在相同的吸附时间里流速越小树脂的吸附量越大。因为溶质与树脂的接触时间越长，树脂对溶质的吸附越多，流失的就越少。所以4 BV／h流速吸附效果较差，2 BV／h流速的吸附效果最好，故HZ816大孔树脂富集纯化柿叶黄酮物质的吸附流速为2 BV／h。

图1 不同流速对柿叶黄酮的吸附曲线

2.1.3 上样液质量浓度对HZ816树脂吸附柿叶黄酮的影响

不同上样浓度条件下黄酮吸附曲线见图2。从图2可看出，质量浓度为5.229mg／mL的漏出曲线十分平缓，上样浓度越大，曲线越陡直，黄酮漏出越多。上样浓度越小则吸附率越高，上样浓度的大小与吸附率成反比，浓度越小越有利于黄酮与树脂的充分接触，当浓度过大时，由于孔容的限制，过多的黄酮会流失，当上样液柿叶黄酮为5.229mg／mL时，其吸附率为91.82%，吸附效果最佳。故HZ816大孔树脂吸附柿叶黄酮物质的适宜质量浓度为5.229mg／mL。

图2 不同上样浓度对柿叶黄酮的吸附曲线

2.1.4 上样液pH值对HZ816树脂吸附柿叶黄酮的影响

不同上样液pH条件下黄酮吸附曲线见图3。从图3可以看出，上样液的pH对黄酮的浓度也有一定的影响，3条曲线变化趋势都趋于平稳，pH为6.0和4.5的曲线在pH为3.1之上，漏出量明显比较大，pH越小，吸附率越高，吸附效果越好。这是因为在酸性较强时形成“佯氧”，偏碱性的时候分子中酚羟基H＋易失去，形成离子结构，不易被吸附［12］。pH为6.0和4.5的吸附率较差，pH为3.1的吸附率较好，综合考虑树脂吸附效果，3.1为最适吸附上样液pH。

图3 不同上样pH对柿叶黄酮的吸附曲线

2.1.5 不同解吸流速对柿叶黄酮洗脱的影响

考察不同洗脱流速对柿叶黄酮的洗脱效果如图4。从图4可知在3 BV／h洗脱速率下洗脱曲线峰高，且图形面积大，洗脱量大，洗脱成分相对集中，有利于富集纯化。2 BV／h和4 BV／h富集量相对来说比较少，这是因为在适当流速下，乙醇能够充分溶解被树脂吸附的黄酮，但流速过快时，乙醇洗脱出来的黄酮量较少。故选择3 BV／h作为大孔树脂富集纯化柿叶黄酮物质的适宜洗脱流速。

图4 不同洗脱速度对柿叶黄酮的洗脱曲线

2.1.6 洗脱剂乙醇不同体积分数对柿叶黄酮洗脱的影响

选择不同的乙醇浓度洗脱柿叶黄酮，洗脱效果如图5，由图5可知3种不同浓度乙醇的洗脱曲线都有一个最高点，后几管的曲线趋于平稳，洗脱出来的量越来越少，用50%乙醇体积分数洗脱的柿叶黄酮折线图峰较高，洗脱相对集中，洗脱量较大，40%和60%乙醇体积分数洗脱的曲线洗脱量较少，所以选择50%体积分数乙醇洗脱为佳。

图5 不同体积分数乙醇对柿叶黄酮的洗脱曲线

2.2 柿叶黄酮对油脂抗氧化活性的影响

2.2.1 柿叶黄酮对动物油脂抗氧化的影响

不同柿叶黄酮的量和维生素C对猪油的抗氧化作用结果如表2所示。由表2可知，柿叶黄酮对猪油具有明显的抗氧化作用，这种作用随着它在猪油中使用量的增大而增强，尤其在试验后期（第10天以后），说明柿叶中的黄酮类化合物对猪油的抗氧化作用十分明显。

表2 不同柿叶黄酮量和抗坏血酸对猪油的抗氧化比较

2.2.2 柿叶黄酮对植物油抗氧化的影响

在大豆油中分别加入不同柿叶黄酮量，与加入抗坏血酸的大豆油的抗氧化作用结果如表3，随着时间的变化，加入不同黄酮含量的提取液POV值慢慢变大，但比空白对照的都要小，说明柿叶黄酮对大豆油有一定的抗氧化作用，而且POV值随着黄酮含量的增大而减小，说明黄酮含量越大，抗氧化作用越大，加入2.0mg的柿叶提取液其抗氧化作用比加抗坏血酸的还要好。

表3 不同柿叶黄酮量与抗坏血酸对大豆油的抗氧化比较

3 结论

以柿叶粗提物为原料，考察各种大孔树脂对总黄酮的动态吸附效率，筛选出了对柿叶总黄酮纯化效果较好的大孔树脂为HZ816，其吸附率为93.31%，洗脱率为92.55%。HZ816树脂动态纯化的较适工艺参数为：上柱流速为2 BV，上样柿叶黄酮质量浓度为5.229mg／mL及上样液pH为3.10；洗脱流速3 BV，洗脱剂的乙醇质量分数50%为较佳的洗脱条件。

对柿叶黄酮的抗氧化研究结果表明，柿叶黄酮的抗氧化性较强，这种作用随着它在油脂中使用量的增大而抗氧化性增强。通过对猪油和大豆油的抗氧化效果试验发现，柿叶黄酮对猪油抗氧化性能比抗坏血酸强，对大豆油试验表明柿叶黄酮有一定的抗氧化作用，加入2.0mg柿叶黄酮的抗氧化作用可与加入抗坏血酸的稍强。试验表明柿叶黄酮是一种很有潜力的天然、安全、高效的新型抗氧化剂。

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Separation and Antioxidation Efficacy of Persimmon Leaf Flavonoid

Lin Guorong Luo Suli
（Putian University College of Environmental and Biological Engineering，Putian 351100）

The experiment has taken persimmon leaf crude extractas rawmaterials.The flavonoids from persimmon leaf was purified bymacroporous adsorptive resin HZ816.The results showed that the dynamic adsorption and elution ability optimized technological parameter was normal temperature 2 BV adsorption column，the concentration of the sample 5.229mg／mL，pH 3.10，elution flow rate of3 BV，and 50%ethanol elution.Anti－oxidative effect of flavonoids from leaves of diospyros kaki on lard has been studied.The results showed that the flavonoids could delay the lipid peroxidation reaction of flavonoid extracted from leaves of diospyros kaki significantly.The antioxidative effect of flavonoid on lard was better than thatof VC，and the flavonoid should be a potential safe and effective antioxidant natural product.

persimmon leaf，flavonoid，isolation，macroporous resin，antioxidation

R284.2

A

1003－0174（2015）03－0062－05

福建省高校服务海西建设重点项目（2008HX01）

2013－12－08

林国荣，男，1969年出生，副教授，营养与生物制药