高山被孢霉产花生四烯酸育种及发酵调控研究进展

凌 瑞，孙立洁，2*，陈祥松，袁丽霞，吴金勇，潘 淼，姚建铭*

(1．中国科学院合肥物质科学研究院等离子体物理研究所，安徽合肥230031;2．中国科学院湖北产业技术创新与育成中心，湖北武汉430072)

花生四烯酸(Arachidonic acid，简称 AA、ARA)，即全顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸，是人体中最重要的一种不饱和脂肪酸(PUFA)，在脑和神经组织中的含量占总PUFA 40%～45%。花生四烯酸在机体内可呈现多种功能，它是生物体内合成多种二十烷类的前体，如前列腺素(Prostaglandins)、白细胞三烯(Leukotrienes)、血栓烷素(Thromboxanes)等，这些生物活性物质对脂质蛋白的代谢、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等人体免疫及心血管系统具有重要的作用。另外，ARA对促进婴幼儿大脑发育也具有重要意义，尤其对自身合成量较低的婴幼儿而言，补充花生四烯酸尤为重要。国家卫生部在1999年正式批准花生四烯酸作为新型营养强化剂。目前，花生四烯酸已经被世界卫生组织等国际权威机构推荐，作为营养剂补充添加到婴儿配方奶粉中，2012年卫生部颁发《食品安全国家标准-食品营养强化剂使用标准》(GB 14880—2012)，花生四烯酸作为食品添加剂确定为来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)。笔者对高山被孢霉产花生四烯酸的育种及发酵调控研究进展进行了综述，并对其研究前景进行了展望。

1 高山被孢霉产花生四烯酸的育种

为实现高山被孢霉发酵过程达到高效低耗，进一步提高花生四烯酸的产量水平，高产菌种的选育成为前提和基础。常见的菌种选育方法有经典育种法及定向育种。经典育种法包括自然选育及诱变育种，而定向育种包括杂交育种及基因工程育种等方法。

1．1 经典育种 经典育种包括自然选育及诱变育种，自1987年Nagao Totani等［1］筛选到高产ARA的高山被孢霉菌株以来，国内外对高山被孢霉的菌种选育便广泛开展，并已取得较大的成效。

1．1．1 自然选育。一般菌种经过多次传代或长期保藏后，由于自然突变或异核体和多倍体的分离等原因，使有些细胞的遗传性状发生改变，造成菌种不纯，在工业生产中往往采用减少传代及自然选育的方法以减弱菌种退化。自然选育是指对自然菌株进行分离纯化及复壮，这种方法简单易行，然而较难获得符合生产要求的优良菌株，因此自然选育往往成为辅助手段。

1．1．2 诱变育种。诱变育种是迄今为止国内外提高产量及发酵性能的主要手段。对高山被孢霉的诱变育种主要包括3种:物理诱变、化学诱变及生物诱变。

1．1．2．1 物理诱变。物理诱变具有操作简单、突变率高、诱变产物对环境威胁相对较小等优势而得到广泛应用。常见的物理诱变技术主要有紫外诱变以及α、β、γ射线诱变和离子注入及微波诱变等。

紫外线诱变是较为普遍的诱变方法，操作简单、突变率较高，诱变的发生是由于紫外辐射使DNA分子形成嘧啶二聚体，二聚体的出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，进而阻碍碱基间的正常配对。2007年王安琪等［2］用紫外线作为诱变剂，分别通过15℃的低温和0．09 mg/ml乙酰水杨酸的筛选作用，得到2株花生四烯酸产量有较大提高的菌株，分别为LT1112和A1113，花生四烯酸产量分别提高46．41%和53．15%。

微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围为300～300 000 MHz，对生物体具有热效应和非热效应，使生物体内产生各种生理、生化功能的变化，并表现出频率和功率的选择性，在农作物及微生物育种方面已被广泛应用［3］。2009年李丽娜等［4］采用两轮微波诱变及菌种筛选AA产量为2．61 g/L，比原始对照菌株提高了3．18倍，且遗传性能稳定。2003年周蓬蓬等［5］采用微波等离子作用高山被孢霉T105，筛选到高产菌R254，该菌的最高生物量达29．3 g/L，油脂11．5 g/L，花生四烯酸 4．20 g/L，花生四烯酸产量为原出发菌株的1．35倍，进而采用补糖工艺可进一步提高花生四烯酸产量，达到出发菌株的2．40倍。

笔者所在课题组最早将离子束诱变应用到微生物育种，并且是全世界最早将离子束诱变技术应用于高山被孢霉的科研单位，通过离子束诱变获得的高产ARA高山被孢霉菌株已在嘉必优生物工程(武汉)有限公司扩大生产。2000年姚建铭等［6］利用离子束注入技术对高山被孢霉进行诱变，筛选到1株高产菌，可得生物量30．80 g/L，菌体油脂含量达25．8%，花生四烯酸的含量占总脂的45．37%，较出发菌的AA产率提高了62．36%，且传代稳定。2003年袁成凌等［7］在10 keV、3×1014N+/cm2条件下对高山被孢霉进行离子注入处理，最终获得1株花生四烯酸高产菌，其发酵液中的油脂含量近40%，且花生四烯酸得率较对照组提高了约130%。2012年中国科学院等离子体所余增亮等［8］通过离子束注入法进行菌种改良并对温度、溶氧和pH等进行发酵培养调控，得到高产菌株，其ARA产率为9．89，已达到国内领先水平。中国科学院等离子体所研究的低能离子束的诱变方法已成功应用于工业生产中，此方法可以在损伤较轻的前提下获得更高的突变率和更宽的突变谱，在微生物及水稻诱变育种等领域的成效已得到广泛应用及关注［9-12］。

Wang Wenxiang等［13］于2014年采用60Co对高山被孢霉进行不同辐射量的诱变，且通过进一步筛选最终获得ARA含量提高1．65倍的新菌株，其油脂含量高达40．51%。2004年马瑞雪等［14］利用深黄被孢霉发酵法生产多不饱和脂肪酸，并利用60Co对其进行辐射诱变，得到花生四烯酸占油脂含量的32%。

1．1．2．2 化学诱变。用化学诱变剂处理菌株，以诱发遗传物质的突变，进而根据育种目标对这些变异进行鉴定、培育和筛选，最终育成新品种。化学诱变剂包括烷化剂、碱基类似物、移码突变剂等，通过改变碱基和基因序列等在DNA复制时发挥诱变作用。常用作诱变剂的主要有硫酸二乙酯(DES)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、N-甲基-N′-硝基-N 甲基亚硝基胍(MNNG)等。

周蓬蓬等［15］于2000年采用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)对由高山被孢霉出发菌株制备的原生质体进行诱变育种。结果表明，采用体积分数为10%的DES诱变3 min，获得高产突变株M20，其花生四烯酸产量比对照株提高了4．4倍，而且突变株传代稳定。这说明采用原生质体诱变育种是获得花生四烯酸高产菌株的有效方法之一，这类烷化剂通过置换DNA分子的氢原子可分别作用于腺嘌呤及鸟嘌呤的N7及N3位点。

2004年Eiji Sakuradani等［16］用MNNG诱变高山被孢霉得到n-3脱氢酶活性较低的突变株，其ARA产量由3．74 g/L上升至4．97 g/L。MNNG是一种广泛使用的化学诱变剂和致癌剂，可直接作用于DNA诱发基因突变及染色体变异。2013年王婷婷等［17］利用紫外线-氯化锂复合诱变的方式得到的诱变菌株，其AA产量提高了141%。

1．2 定向育种 定向育种主要包括杂交育种及基因工程育种，其中自然杂交、原生质体融合是杂交育种的主要方法。

1．2．1 原生质体融合。原生质体融合是指将2个亲本的细胞壁用酶解的方法去除，在高渗溶液及助融剂的作用下融合成为异核体，进而达到基因重组的目的。原生质体诱变的优点是没有细胞壁屏障，诱变剂容易进入细胞内，发生变异的概率更大、时间更短、效率更高，高产花生四烯酸菌株(如深黄被孢霉、轮梗霉等)均已实现原生质体的诱变处理，并且获得高产菌株。

2009年于长青等［18］对出发菌株深黄被孢霉制备的原生质体进行紫外诱变，结果表明经过诱变及菌种筛选所获得高产菌株YZ-124的生物量达到了36．5 g/L，微生物油脂含量为19．2 g/L，花生四烯酸含量达4．72 g/L，并且遗传性能稳定。以轮梗霉发酵产花生四烯酸也有报道以其原生质体进行诱变处理。2008年赵沫等［19］以轮梗霉紫外诱变突变株为出发菌株，制备其原生质体并连续采用紫外线、微波及硫酸二乙酯进行多轮诱变，通过15℃低温和0．12 g/ml乙酰水杨酸初筛及摇瓶发酵复筛，得到花生四烯酸产量提高的突变株，其花生四烯酸占总脂肪酸的含量从出发株的8．03%提高到15．10%。

1．2．2 基因工程育种。基因工程育种是在分子水平上对基因进行操作的技术，其原理是基因重组，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使导入基因在受体细胞内表达，基因工程育种还包括自有基因的过表达、删除、修饰和点突变等方法。2011年Wang Lei等［20］对高山被孢霉进行基因测序，结果发现有近60%的基因参与高山被孢霉脂肪酸代谢途径中。另外，研究人员对ARA合成途径中的关键酶进行了大量系统的研究工作，克隆到关键酶的编码基因，并进一步将这些关键酶的基因在其他缺乏此类酶的生物体系中实现了表达。研究表明，利用基因工程手段改造高山被孢霉以提高ARA的发酵水平日益受到研究人员的青睐。

2015年Eiji Sakuradani等［21］通过基因枪法将基因与质粒结合后导入尿嘧啶合成缺陷型菌株，并成功获得完整型高山被孢霉菌株，该研究首次将基因枪法成功应用于高山被孢霉，必将促进基因枪法在微生物诱变育种上的应用。2012年Zhang Changjie等［22］通过pD4质粒将GLELO基因导入高山被孢霉原生质体中，在Ca2+及PEG的作用下发生基因重组，且使高山被孢霉发酵产ARA的含量提高近30%。2005年Seiki等［23］将抗生素Zeocin抗性基因整合到高山被孢霉中，利用该突变株过量表达同源多不饱和脂肪酸延长酶基因，从而增加了ARA的产量。日本科学家落合美佐于2004年以被孢霉属脂质生产菌的营养缺陷型菌株(如尿嘧啶缺陷型菌株)为宿主进行转化。采用与此营养缺陷型互补的基因作为标记基因，将该标记基因导入宿主，然后以上述宿主营养缺陷型的回复为标记，筛选转化株，结果表明GLELO基因导入株中花生四烯酸在总脂肪酸中所占的比例增加18%～42%［24］。基因工程在大肠杆菌中的应用更为广泛，2004年Dai Minghua等［25］将2株营养缺陷型大肠杆菌制备原生质体且进行基因重组，最终获得原养型菌体。

2 高山被孢霉发酵调控

筛选到高产菌株后，若能结合高山被孢霉发酵调控及AA代谢则会有更好的效果，根据高山被孢霉的生长、基础代谢、代谢调节以及次生代谢合成的特点，进行发酵过程控制与优化。近年来，人们对高山被孢霉的发酵路径及代谢调控等进行了大量研究，发酵调控主要包含碳氮比调控、分批补料、提高溶氧等途径，ARA代谢则包含切断或减弱非ARA生物合成的支路代谢、增加前体物的合成、选育△6-脱氢酶活力强的突变株等［26-29］。

2015年Wu Wenjia等［30］研究表明高山被孢霉发酵路径中，ARA的积累主要发生在几类重要的脂肪酸后，即发生在代谢的168～192 h，并以TAG作为主要的积累形式。在发酵反应体系及培养条件方面，2014年Wang Wenxiang等［31］通过在发酵过程中的逐步提升温度及由气升式反应器替换普通发酵罐，使ARA产量提升至4．79 g/L。2011年南京工业大学焦敏等［32］采用最小二乘支持向量机和广义回归神经网络2种方法建立了花生四烯酸发酵过程的模型，这为发酵法产ARA的代谢控制奠定了基础。在发酵过程中通过改变一些关键的影响因素可以促进ARA的积累，这类研究也比较普遍，如在高山被孢霉不同的培养时间改变温度、溶氧、添加乙醇等发人挥胁迫作用等。2010年Chao Peng等［33］研究发现在高山被孢霉发酵过程中其生物量的提高及ARA的积累的最适温度分别为25和20℃，因此在发酵初期在25℃条件下培养以促进生物量的积累，在发酵108 h后调整温度至20℃以促进合成ARA。2010年Chao Peng等［34］通过在高山被孢霉发酵液添加氧载体正十六烷并在发酵过程中2次调整溶氧，从而达到提高ARA产量的作用。2008年Ming Jiejin等［35］通过在高山被孢霉发酵5 L罐中以二步法调整转速及溶氧，并在发酵5 d、7 d分别添加3%和5%的乙醇来促进油脂的积累，最终使ARA产量提高了1．7倍。

3 展望

近些年，随着ARA在食品、医药和化妆品等多领域需求的逐步提高，以被孢霉发酵法生产ARA必将大规模走向产业化。目前，用传统方法进行花生四烯酸菌种选育已有不少研究，且获得了一些有价值的菌株，但是很多菌株产量仍然不高，且获得新菌种的周期长、新菌种稳定性较差。随着高山被孢霉基因组测序工作的完成，从大量的功能基因序列中也已定位出有价值的特异基因片断，从而使人们对ARA生物合成的关键酶在分子水平上的认识逐步加深，并且研究人员已成功构建了多种高山被孢霉的转化系统，为今后基因工程育种奠定了基础。另外，近几年兴起的多基因组工程［36］及全局转录机器工程［37］在微生物育种领域的应用也值得关注，其特点是可以深入到基因组及转录组层面进行育种，通过靶向改变目的片断表现出其无可比拟的优势。

从微生物发酵生产的角度出发，选育性状优良的生产菌株不可或缺，然而在高山被孢霉发酵的代谢调控机制、发酵后处理过程多种脂肪酸的分离以及如何在保证ARA高产的前提下降低二十四碳烷酸的含量等方面仍存在一系列问题，因此，在今后研究中利用新的生物技术对菌种进行选育及发酵代谢的机理研究将成为必然趋势。

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