白血病发生发展过程中的克隆演变

刘黔伟 综述 魏辉 审校

中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院白血病诊疗中心，天津300020

白血病发生发展过程中的克隆演变

刘黔伟 综述 魏辉#审校

中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院白血病诊疗中心，天津300020

白血病是一组多基因病，其克隆演变过程受到多种因素的调控。白血病的克隆演变过程是一个顺序性、多步骤基因突变的积累过程。白血病优势克隆的产生，正是机体内环境和药物的选择性与各种亚克隆自身适应性相博弈的结果。随着二代测序技术的深入发展，学者们对白血病的克隆演变过程有了更加深入的认识，而且这种认识还在不断地深化。这必将使白血病的诊断和治疗模式发生翻天覆地的变化。

白血病；克隆演变；基因突变；RNA；耐药

白血病的克隆演变是一个多步骤的过程；在演变过程中，造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）发生累积性基因突变，且突变随时间推移而被不断积累。在驱动突变与非驱动突变的协调作用下，白血病不断地发展、演变，该过程同时受到非编码RNA的调控，以及药物与内环境的选择。白血病克隆演变过程与白血病自然病程、复发及耐药机制均有密切关系。

1 基因突变对造血细胞的作用

1.1 基因突变的作用效应

涉及白血病的基因突变数目较多，不同的基因突变可通过不同的方式产生作用。TET2、DNMT3A、IDH1/2等基因突变可引起DNA甲基化[1]。TET2酶可以使5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5 mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5 hmC）[2]，从而调节DNA甲基化与去甲基化的动态平衡，DNMT3A与IDH1/2分别通过甲基转移酶与异柠檬酸脱氢酶使胞嘧啶甲基化，从而影响DNA复制和肿瘤的发展演变[3-4]。而ASXL1、EZH2及UTX等基因突变则通过组蛋白修饰发挥作用，研究[5]表明，在骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者中，ASXL1、EZH2和UTX突变可通过修饰组蛋白导致基因表达的异常调节。RUNX1可通过转录调节参与到急性髓系白血病（acutemyelocytic leukem ia，AML）的演变过程，JAK2可通过信号转导途径增加造血细胞对细胞因子的敏感性，使血细胞异常增殖[6]。此外，还有多种基因突变通过不同方式直接或者间接地参与白血病的克隆演变进程。

1.2 基因突变累积对造血细胞的影响

白血病的发生发展受到多个基因的影响。从正常HSC到白血病前期的基因累积阶段，获得的基因突变主要有两方面作用：一方面使HSC保持自我更新的能力，另一方面使之发生分化。当形成白血病克隆后，基因突变的主要作用是导致细胞增殖，形成生存优势。研究发现，TET2突变、DNMT3A突变等维持HSC自我更新的基因突变倾向于在演变过程的早期出现[7]。而Fms样酪氨酸激酶3内部串联重复（Fms-like tyrosine kinase3-intenal tandem duplication，FLT3-ITD）突变损伤HSC自我更新能力可能属于白血病进展期的事件[8]。

在使用酪氨酸激酶抑制剂治疗14例慢性髓系白血病（chronicmyeloid leukem ia，CML）患者的过程中，出现了Ph阴性的克隆性染色体异常；对这14例患者进行了突变检测，6例可以检测到基因突变，突变的基因包括DNMT3A、EZH2、RUNX1、TET2、TP53、U2AF1和ZRSR2，其中2例的基因突变在初诊时Ph阳性的克隆中也可以被发现；对1例初诊CML患者的分析发现，在Ph阴性和Ph阳性克隆中，都存在DNMT3A突变；由于在Ph阴性和Ph阳性细胞中同时存在BCR-ABL以外的基因突变，因此，这一研究提示BCR-ABL以外的基因突变对CML发生发展过程中的克隆演变发挥着重要作用[9]。

2 非编码RNA与白血病的克隆演变

2.1 非编码RNA在白血病克隆演变中的作用

2.2 lncRNA与白血病的克隆演变

在对148例未治疗的60岁以上细胞遗传学正常的AML患者的研究中，针对48种lncRNA进行评分，发现lncRNA评分不理想者的完全缓解率较低（54%vs 89%）,无病生存率与总生存率均较低[11]。已有大量研究证实lncRNA直接或者间接参与白血病的克隆演变过程，lncRNA可通过调节分化过程中的基因表达参与白血病的克隆演变，如：HOTAIRM 1（HOX antisense intergenic RNAmyeloid 1）可调节原始粒细胞分化所必需的几个基因的表达，包括编码造血过程中关键转录因子的HOXA1与HOXA4基因。全反式维甲酸诱导分化过程中，正是由于短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）介导的HOTAIRM 1分解，抑制了HOXA1与HOXA4的表达[12]。研究[13]表明，lncRNA-P21与BCR-ABL共同调节不均一性核内核糖蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleo-protein K protein，hnRNPK）的含量，其可能参与CML细胞的演变过程。lncRNA MEG3可通过激活p53间接参与AML和MDS的演变过程[13-14]。

非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）在白血病克隆演变过程中的调节作用逐渐被重视。ncRNA包括短片段非编码RNA（siRNA、m iRNA、piRNA）和长片段非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。siRNA（small interfering RNA）通常不存在于脊椎动物中，可依赖于质粒或病毒间接作用于细胞。而miRNA（m icroRNA）作为基因表达的一种调控机制，直接参与某些白血病的发病机制，如miR-15a、m iR-16a与慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukem ia，CLL）发病密切相关[10]。piRNA（piw i-interacting RNA）具有维持干细胞功能及维持mRNA稳定性的作用，可能参与白血病的演变过程，但该方面的已有研究较少。而备受关注的lncRNA可通过多种途径参与白血病的克隆演变过程。

3 白血病的克隆演变过程

3.1 演变过程的多样性

白血病的克隆演变是一个多步骤、发展性的动态演变过程。不同疾病的演变过程存在差异，即使同一疾病也存在着多种不同的演变过程。Anderson等[15]通过荧光原位杂交技术模拟重建ALL的克隆演变过程，发现最简单的是仅有3个亚克隆组成的线性演变模式，而复杂者有超过10个亚克隆组成的分支树状模式。

3.2 白血病的克隆演变模式

白血病的克隆演变模式，正是基因突变组合随时间推移的不同积累模式。在已发现的三种关于AML的克隆演变模式中，较为经典的是早期发现的、在原发AML患者中检测到的克隆演变模式，AML患者首先获得AML1-ETO突变，而后在此基础上获得RUNX1、CEBPA或FLT3等突变。有研究[16-17]发现了关于原发AML及继发性AML的演变模式。原发AML的一种演变模式是：患者首先获得DNMT3A突变，而后获得IDH2突变并一直保持该突变，随后再获得NPM 1突变，并在此基础上获得FLT3或RAS突变，最终形成AML克隆[16]。而另一种模式是关于继发性AML的克隆演变，患者首先获得U2AF1突变，而后获得ASXL1突变，在此基础上获得IDH2突变，最终形成AML克隆[17]。与继发性AML相比，原发AML涉及的基因突变步骤较少，这也许可以解释原发性AML好发于较年轻者、而继发于MDS的AML则好发于老年人的原因。

白血病的克隆演变过程有多个基因参与，一些基因异常在AML诊断和复发过程中都会存在，而另一些基因异常则在复发时可能会丢失，前者可以被认为是AML发生过程中的驱动基因异常。Luise等[18]通过深度测序法对核型正常的AML患者进行研究后发现，在AML缓解后检测不到FLT3和NRAS等非驱动基因突变，而53%（25/47）的AML在缓解后仍可以检测到驱动基因突变，这些驱动基因突变会随着AML病情的变化而变化。DNMT3A、TET2、RUNX1和IDH2在AML缓解期中持续存在的频率分别为28%、11%、6%和4%。DNMT3A在缓解期持续存在提示可能存在更早的复发（270天和508天，P＝0.111）。在对外周T细胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphomas，PTCL）患者的研究中，TET2突变、DNMT3突变不仅出现在T细胞肿瘤中，也可见于正常淋巴细胞及髓系祖细胞中。这些突变起源于造血分化过程中的不成熟期，当正常细胞获得驱动基因突变后，会使其具备向恶性克隆演变的倾向[19-20]。

血液系统恶性肿瘤的发生至少需两个以上的遗传学打击才能发生病变。驱动基因突变使细胞具备恶性克隆演变的倾向，在驱动突变基础上的二次打击是形成恶性克隆的直接原因。Welch等[21]通过对AML-M3测序并与核型正常的AML-M1样本及正常人造血干/祖细胞（hematopoietic stem/ progenitor cells，HSPC）基因组进行比较，发现AML基因组的大多数基因突变可随机发生在正常人的HSPC中，在此基础上仅出现1～2个额外的、起协同作用的基因突变就可以产生肿瘤的基础克隆，肿瘤的基础克隆再获得额外的、起协同作用的基因突变就可出现疾病进展或复发过程中的各种亚克隆。

TET2、ASXL1、DNMT3A等驱动基因突变可长期存在于正常人造血细胞中，而FLT3、NPM1等非驱动基因突变往往出现较晚，与亚克隆的特性有关[22]。在慢性粒单核细胞白血病的克隆演变过程中，TET2基因突变可使细胞发生驱动性突变并长期潜伏，当发生二次损伤时，如SRSF2基因突变，可导致异常分化，产生恶性克隆[23]。

4 克隆演变与耐药机制

肿瘤的基因型和表型变化在时间和空间上是一个动态演变的过程，肿瘤异质性可以由潜在突变引起，也可产生于细胞周期随机突变。克隆演变形成的肿瘤异质性是治疗失败的重要原因，多药耐药可能形成于多途径治疗期间。肿瘤化疗在克隆演变过程中形成了选择压力，耐药性产生的分子机制随药物种类的不同而不同，即使同一药物也存在着多种耐药机制[24]。

化疗压力下肿瘤的克隆演变过程，正是内环境因素与药物共同作用的选择过程。在一项针对149例CLL患者的研究中，选取18例患者进行全染色体测序和基因分析（其中12例采取化疗，6例未化疗），发现化疗组中有10例（10/12）发生了克隆演变，未予化疗的对照组仅1例（1/6）发生了克隆演变；在化疗组发生克隆演变的10例患者中，5例为分支演变，5例为线性演变[25]。研究资料表明[24]，肿瘤耐药性出现前的一些非优势亚克隆可能是治疗后出现耐药的潜在原因，在化疗压力下，优势肿瘤克隆发生新突变，也是肿瘤耐药机制形成的重要原因。

5 克隆演变与肿瘤复发

白血病复发一直是白血病治疗方面的一个难题，也是很多患者死亡的重要原因。化疗作用下肿瘤克隆演变进程直接关系着肿瘤的复发过程。Corces-Zimmerman等[16]对缓解期AML患者体内出现的白血病前期基因突变进行了分析，发现白血病前期突变存在于CD34+祖细胞和各种成熟细胞中，表明这些拥有白血病前期基因突变的HSC能够在化疗中存活，可成为肿瘤复发的潜在来源。同时，他们根据对患者复发与初诊时样本进行的全基因组测序对比结果，提出肿瘤复发可能的几种克隆演变模式：①在初诊时优势克隆的基础上获得了新的基因突变；②由初诊时非优势亚克隆发展而来；③治疗不彻底，由微小残余病灶复发而来，仍是初诊时的优势克隆；④由具有白血病前基因突变的HSC获得新的基因突变形成。

在白血病患者中，TET2、IDH1/2、DNMT3A等早期基因突变在初诊和复发时都较稳定，而FLT3和RAS等突变在初诊和复发时出现的情况具有较大波动性。因此，选择适当的基因突变作为肿瘤复发检测指标具有一定的挑战性，选用TET2、IDH1/2等持续存在的突变作为检测指标的特异性会较差，而选用FLT3、RAS等突变作为检测指标的敏感度则较低。有研究[26]发现：运用实时荧光定量PCR将NPM 1作为检测指标可以有效检测出AML中的微小残余病灶；同时，NPM1也是AML患者一线治疗期间评估预后的有效指标。

6 结语与展望

白血病的克隆演变过程是一个多步骤、顺序性的突变累积过程。白血病优势克隆的产生，正是机体内环境、药物选择与各种亚克隆自身适应性相博弈的结果。随着新一代测序的普及、RNA-seq技术的发展及全基因组关联性分析等方法的运用，研究者们对于白血病克隆演变的认识取得了一定的突破，同时也为临床工作提供了一些思路：①是否可根据不同的克隆演变机制将疾病进行更为细致的分型并加以研究？②化疗方案是否应同时考虑已出现的、可能成为复发来源的非优势亚克隆？③针对持续存在的驱动基因突变进行靶向化疗是否可以取得更好的疗效？由于克隆演变进程本身的复杂性及科学技术的限制性，尚有很多问题不能找到答案。相信在不久的将来，随着新一代测序技术的普及和测序分析技术的完善，研究者们一定会对白血病克隆演变过程有更加深入的认识。

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2015-04-02）