慢性淋巴细胞白血病的克隆演变

吕瑞 综述 李增军 审校

中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院淋巴瘤中心，天津300020

慢性淋巴细胞白血病的克隆演变

吕瑞 综述 李增军#审校

中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院淋巴瘤中心，天津300020

慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukem ia，CLL）的克隆演变、遗传异质性均影响疾病的发展及治疗决策的选择，其中线性模式及分支模式是目前公认的CLL的主要克隆演变模式。基于新型分子生物学技术的发展，相关研究正在逐步揭开克隆演变及遗传异质性的神秘面纱，为预测疾病复发、治疗反应及耐药指引了方向。

慢性淋巴细胞白血病；克隆演变；遗传异质性

CLL是一种成熟B淋巴细胞的恶性克隆性疾病，其临床表现具有异质性：大部分患者的疾病呈惰性进程，逐渐出现治疗指征，并于治疗后可在相当长的时间内维持稳定；少部分发病后迅速进展并出现耐药，甚至短期内发生转化，成为侵袭性淋巴瘤。重现性遗传学异常对CLL预后及治疗反应的提示作用已得到重视并被用于临床[1-4]，随着研究的深入及深度测序技术的开展，不少学者发现，在CLL发展及治疗过程中，其部分优势遗传学特征发生了一系列的变化，即存在克隆演变现象。本文旨在针对克隆演变及其模式进行总结，以期探讨其临床意义。

1 CLL的遗传异质性及克隆演变

CLL细胞因其遗传学异质性的不同而表现出各异的生物学行为。例如：IgHV突变状态可影响CLL的临床表现及预后[5]；单独的13q染色体缺失通常被认为是预后良好的标志；11q缺失往往以多发淋巴结增大为突出表现，具有侵袭性，但多数情况下对氟达拉滨有治疗反应；17p缺失及TP53突变往往表现出高度的侵袭性，且对绝大多数细胞毒性药物耐药[1-2]。随着染色体核型、间期荧光原位杂交（interphase fluorescence in situ hybridization，iFISH）技术在临床上的应用，以及比较基因组杂交、单核苷酸多态性分析、深度测序技术的发展，学者们对CLL细胞遗传学特征的认识进一步加深，对其发生、发展过程中的克隆演变更加重视。

克隆演变的基本理论[6]为：肿瘤细胞存在广泛的克隆演变现象，其内部克隆异质性和在多种选择压力下的克隆进化是肿瘤复发进展并导致最终治疗失败的重要原因。在CLL中，不同遗传学异常在疾病发生的不同阶段的分布不均衡[1，7]：在新诊断的CLL患者中，单独的13q缺失占35%～40%，12号染色体三体占15%，11q缺失占15%～20%，而17p缺失/TP53突变仅占5%～10%；但在复发/难治的CLL中，17p缺失/TP53突变的比例却明显增高。这提示，在CLL细胞中，某些遗传学特征是在疾病发生较早期即表达的，而某些遗传学因素则是在疾病发展过程中获得的。

在对CLL克隆演变的研究中，Janssens等[8]应用iFISH技术动态监测了95例CLL患者，发现11例患者在病程中有新发的11q22/17p13缺失；与此同时，部分携带异常遗传学克隆的患者经治疗后，其原有的异常克隆被完全抑制，以致无法被检出。Zhang等[9]应用单核苷酸多态性技术，较好地阐释了CLL的克隆多态性并为进一步研究创造了条件。Braggio等[10]采用比较基因组杂交方法，按照治疗前后的不同时间点检测了22例CLL患者的遗传学特征，证实该法可有效发现优势克隆的变化，从而验证克隆演变现象的存在。尽管上述结果不能完全反映CLL基因组全貌，且上述技术的应用仍受到一定程度的限制，但仍有力地证实CLL中广泛存在遗传学异质性及克隆演变，为进一步的研究奠定了基础。

随着深度测序技术的出现，人们对CLL的遗传学特征有了进一步的认识。除TP53外，BIRC3、SF3B1及NOTCH1基因的突变不但被先后鉴别出，而且还证实了它们与CLL的疾病进展、IgHV未突变状态及不良预后的相关性[2-4，11-14]。Baliakas等[4]入组3400余例CLL患者，研究上述的遗传学特点，发现BIRC3突变在CLL早期患者中的发生率较低（＜3%），NOTCH1突变在12号三体患者的克隆中常见，SF3B1突变在11q缺失的患者中高发，而BIRC3突变在17p缺失的患者中几乎不存在，却常见于12号三体及11q缺失的患者中，从而为克隆突变的不同方式提供佐证；此外，他们同时发现，随着病情的发展，SF3B1及TP53的突变率增高，但NOTCH1基因的突变率却不随之改变，据此推测不同基因突变在CLL的克隆演变过程中可能发挥不同的作用。

2 CLL的克隆演变模式

CLL是一类惰性的B淋巴细胞增殖性疾病，患者的中位生存时间长，肿瘤基因相对稳定；故与增殖性强的恶性肿瘤相比，其克隆演变的研究更困难。随着分子生物学技术，尤其是深度测序技术等新一代测序技术的开展，越来越多的学者将关注焦点集中在CLL的总体演变模式及驱动因子上。

Baliakas等[4]根据SF3B1、TP53及NOTCH1突变率随疾病发展变化的关系推测，NOTCH1基因突变可能作为最初驱动因子在肿瘤发生过程发挥作用，而SF3B1及TP53突变更可能在疾病进展过程中积累并作为克隆发展的后续驱动因子而存在。Ouillette等[15]入组156例CLL（其中42例接受治疗干预）患者，应用单核苷酸多态性（SNP）检测杂合性缺失及获得性拷贝数变异的情况，并用Sanger测序检测突变。他们发现：TP53突变既可在发病阶段就存在，也可在疾病发展过程中“获得”，但无论何时出现，均可作为驱动因素，导致复杂的克隆性异常；在接受及未接受治疗的患者中，化疗本身对克隆演变确实起到促进作用，但化疗所致的遗传学异常却与未化疗患者相同，从而提示优势克隆往往事先存在，而在外界干预因素作用下才被进一步显现；最后，纵向研究结果提示逾99%的患者的遗传学特征与起病时相同，这导致他们进一步提出了CLL克隆演变的线性进展型模式：即，初诊时的克隆可获得一种或多种遗传学异常，但随着病情发展及治疗干预，仅有一种优势克隆被显现出来，而原优势克隆的残存或原优势克隆在内外因素的促进下获得新的遗传学异常是导致疾病复发进展的根源。

在以上研究中，大部分学者均强调单一优势克隆在疾病发展中的主导作用，并未提到其他亚克隆与优势克隆之间的关系，但不少学者在这一领域却有不同的发现。Schuh等[16]利用全基因组测序技术，在3例CLL患者中追踪亚克隆，发现其中1例患者在疾病发展过程维持原克隆不变，但另2例却逐渐显现出与优势克隆伴行的新发亚克隆，从而提示不同CLL患者可能存在不同的克隆演变方式，优势克隆可能与亚克隆之间存在着此消彼长、相互作用的关系。Landau等[17]应用外显子测序法在149例CLL患者中检测新突变时发现：部分异常（如12染色体三体及13q缺失）往往存在于绝大多数的CLL患者中，且在疾病发生的早期即已存在；而TP53、SF3B1及ATM仅在部分克隆中存在，更倾向于表现为亚克隆的特征；伴随治疗出现的新的亚克隆与患者的不良预后相关，这证实了在治疗后进展患者中研究这部分新发分子标志的重要性。此外，Rossi等[18]用深度测序法发现：原少量存在的伴TP53突变的亚克隆经治疗等因素阳性选择后可逐渐取代原先的优势克隆，从而成为导致疾病复发的新的优势克隆；这提示，在CLL的克隆演变过程中，同时存在着非线性的发展方式。

Ojha等[19]用深度测序法在12例患者中发现，33%（4/12）的患者的优势克隆持续存在，而67%（8/ 12）的患者的优势克隆在病程中发生变化。以上研究证实CLL的疾病进展过程中广泛存在两种主要的克隆演变模式，即线性进展模式及分支模式。在线性模式中，优势克隆始终维持不变，只是获得性的遗传学异常使优势克隆的生物学特征发生了改变；而在分支模式中，病程中出现多种亚克隆，它们相互竞争，此消彼长，优势克隆及亚克隆均可同时受自身及各种外界环境因素的影响而产生新的遗传学变异。此外，Ojha等还在2例拥有不同亚克隆的患者中首次发现，其不同亚克隆可在同等外界环境因素作用下产生类似的“反应”，即引起优势及非优势克隆中相同基因的“被趋动”，从而表现出同一干预因素诱导的进化“趋同性”。

因此，CLL的克隆演变源于治疗干预和随机突变的积累。尽管目前研究对其相关模式及驱动因素的揭示仅为冰山一角，还有太多的未知内容，但对其日益深入的了解将为临床提供重要的信息。

3 CLL克隆演变的临床意义

CLL的克隆演变是内因及外因共同作用的结果，对其遗传异质性及克隆演变进行研究有助于学者们加深对疾病进展及耐药的理解，同时在预测疾病转归及指导治疗方面也有重要意义。

首先，克隆异质性与克隆演变的互相促进是导致疾病进展及耐药发生的重要原因。同一肿瘤中可并存多种起源的克隆，可能以一种克隆为主，即优势克隆，这种肿瘤中多种细胞克隆并存的现象被称为克隆异质性[20]。肿瘤的克隆演变继发的耐药往往是治疗失败的关键。基于克隆演变模型，除起病时就具有耐药性优势克隆的原发耐药外，大多数肿瘤起病时的优势克隆均对药物敏感，而其继发耐药的机制分为三个方面[6，21]：一方面，优势敏感克隆一度对治疗有效，但由于自身基因的不稳定性及外界因素（如治疗等）的干预，出现克隆进化和克隆异质性，因获得了新的、耐药相关的遗传学特征而对药物不敏感；另一方面，通过内外因素的选择作用，原先具有耐药特征的亚克隆进一步发展为优势克隆；最后，原先非优势地位的敏感亚克隆在演变过程也可获得了新的耐药特征，并进一步发展成优势克隆，导致疾病的复发进展。目前，CLL继发耐药模式的研究仍以前两种方式为主[16-19]；但不断深入的研究将为CLL的耐药方式提供更多信息。

CLL的克隆演变导致了一系列新遗传学异常的出现，基于新一代分子生物学技术，新遗传学指标的发现不但提高了对CLL预后的判断价值，而且还为所用药物的选择提供了指导。新的预后分期体系[2-4]将17p缺失/TP53突变及BIRC3突变的患者归入高危组，其5年和10年总生存率分别为50.9%和29.9%；将NOTCH1、SF3B1突变及11q缺失/ATM突变的患者归入中危组，其5年和10年总生存率分别为65.9%和37.1%；将12三体及正常核型归入低危组，其5年和10年总生存率分别为77.6%和57.3%；而最后将单独13q缺失的患者纳入极低危组，其相应的5年和10年总生存率分别为86.9%和69.3%，从而使不同遗传学及预后特征的CLL患者得到更好地区分。有学者研究不同遗传学特征对不同新药的反应时发现：TP53及SF3B1突变或BIRC3异常与氟达拉滨耐药相关[22]，NOTCH1突变的患者不能从抗CD20单克隆抗体中获益[3]，抗CD52单克隆抗体联合氟达拉滨/环磷酰胺方案可部分克服TP53突变对CLL的不良影响[23]，BCR途径中BTK抑制剂Ibrutinib和PI3K抑制剂Idelalisib也可克服或部分克服TP53突变引起的不良影响[24]。因此，在CLL治疗伴随的克隆演变过程中，只有充分把握上述遗传学特征，才能在疾病进展的不同阶段准确判断预后并采取行之有效的治疗措施。

克隆异质性无疑是实施个体化治疗的巨大障碍。随着靶向药物及单克隆抗体的出现，CLL的治疗模式也发生着转变。2013年，美国血液年会提出了个体化治疗（tailored）、靶向治疗（targeted）和微小残留病（MRD）清除（total eradiation of MRD）的“3T模式”[24]，旨在通过个体化治疗尽可能减少药物毒性作用，在此基础上尽量消除肿瘤，达到“接近治愈”的目的。对亚克隆存在的认识有助于避免进入从始至终单一用药的误区；而对疾病进展过程中克隆进化具体情况（其保持稳定还是以线性或者分支模式进展）的了解，则是进行危险因素分层并制定个体化治疗策略的关键所在，也是根除所有亚克隆的基础。只有兼顾优势克隆及亚克隆，才有希望在有效治愈的基础上兼顾复发风险的降低，从而全面提高CLL患者的远期治疗效果，延长其总生存时间。

4 总结与展望

CLL的克隆演变在一定程度上是达尔文自然选择模式的反应。肿瘤克隆在其自身及外界因素的影响下，产生一系列基因突变，优势克隆发生“进化”，或者从亚克隆中“选择”出新的优势克隆，从而逃逸不良“环境”，不断增殖并导致病情反复。其中，基因的不稳定性是导致克隆演变的基础，而化疗等关键因素的选择作用是克隆演变的动力。CLL在本质上是一类不可治愈的惰性增殖性疾病，在漫长发展过程中终将走向复发/进展；这一过程涉及多种基因的突变、缺失、易位，甚至表观遗传学调控[25]，并从多方面影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学特征；克隆异质性广泛存在于肿瘤发展的各个阶段，对优势克隆及亚克隆遗传特征的充分重视有助于合理选择用药，有效避免复发。优势克隆的演变及其与非优势克隆之间的此消彼长是耐药的根源，而目前得到公认的CLL克隆演变模式主要包括线性模式及分支模式；对克隆模式发展方向及化疗等关键影响因素和基因不稳定性的研究，有望进一步为预测治疗反应及疾病进展提供方向，并将对临床实践的总体治疗选择产生重大的指导意义。

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R733.7

A

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2015-03-31）