西格列汀对2型糖尿病大鼠chemerin水平的影响

刘炯炯，王长江，胡红琳，戚仁娟，夏 莉，方朝晖

西格列汀对2型糖尿病大鼠chemerin水平的影响

刘炯炯1，王长江1，胡红琳1，戚仁娟1，夏 莉1，方朝晖2

目的研究西格列汀干预对2型糖尿病（T2DM）大鼠各代谢指标及脂肪因子chemerin水平的影响及其可能的机制，并探讨脂肪因子chemerin与T2DM的关系方法将35只雄性SD大鼠随机分为普通饲料喂养组（NC组，n＝10）及高脂饲料喂养组（HF组，n＝25），12周后将高脂饮食喂养的大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素（STZ）35 mg／kg，T2DM大鼠造模成功（n＝20）后随机分为两组：T2DM对照组（T2DM组，n＝10）、西格列汀干预组（SP组，n＝10），ELISA法分别测定干预前后各组大鼠生化指标，Western blot法检测大鼠肾周脂肪、肝脏和肌肉组织chemerin蛋白表达水平结果①T2DM大鼠的血清chemerin、体重（BW）、空腹血糖（FBG）、胰岛素（FINS）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、胰岛素抵抗指数（HOMO-IR）与NC组比较均增高，胰岛β细胞功能指数（HOMO-β）降低，肾周脂肪、肝脏及肌肉组织的chemerin蛋白表达量增加；②西格列汀可降低T2DM大鼠FBG、FINS、TC、TG、LDL、HOMO-IR、血清chemerin水平及肾周脂肪、肝脏组织的chemerin蛋白表达量，提高HOMO-β指数；③相关性分析显示西格列汀干预前后TG、FINS及HOMO-IR始终与chemerin独立相关。血清chemerin水平与肾周脂肪chemerin蛋白表达量呈正相关（r＝0．79，P＜0．05）结论西格列汀可降低血清、肾周脂肪及肝脏组织中chemerin水平，改善血清学各代谢指标，chemerin可能参与T2DM的发生发展。

2型糖尿病；西格列汀；chemerin

目前糖尿病（diabetes mellitus，DM）的患病率日益增高，预计到2030年DM患者数量在全球范围内可达4．4亿［1］。越来越多的研究［2］将2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发生发展归结为脂肪相关信号分子（如瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子等）的分泌及局部炎症反应，chemerin就是一种2007年首次被定义为由3T3-L1脂肪细胞分泌的新的脂肪因子，目前chemerin在T2DM大鼠体内的变化尚无明确结论，而且新型降糖药物西格列汀对脂肪因子chemerin的影响目前鲜有报道。该研究通过建立T2DM模型来研究脂肪因子chemerin在此过程中发挥的作用，及新型降糖药物西格列汀是否通过影响chemerin水平来发挥其作用，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂Roche Modular全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司），稳豪血糖仪（美国强生公司），胰岛素放免试剂盒（北京原子高科公司），ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司），10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司），羟甲基淀粉酶（上海蒙究实业有限公司），chemerin小鼠抗大鼠单克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗小鼠二抗（英国Abcam公司），ECL化学发光显影剂（美国millipore公司）等。

1．2 实验动物普通级SD大鼠35只，雄性4周龄，（100±20）g，购自安徽医科大学实验动物中心。饲养条件为室温（22±2）℃，湿度55%左右，自然昼夜节律，自由饮水摄食。适应性喂养1周后随机分为两组：普通饲料组（NC组，n＝10）和高脂饲料组（HF组，n＝25）。NC组予以普通饲料（由安徽医科大学实验动物中心配制）喂养，直至实验结束；HF组给予高脂饲料喂养。12周后，将HF组的大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（临用前溶解在pH＝4．5的0．1 mmol／L柠檬酸缓冲液中）35 mg／kg，于注射后第7天内眦静脉取血测大鼠血糖，将空腹血糖＞11．1 mmol／L者定为T2DM模型造模成功［3］，死亡5只，造模成功20只。

1．3 干预方式将20只T2DM大鼠随机分为两组：①T2DM对照组（T2DM组，n＝10）：灌胃给予2 ml生理盐水作为空白对照，②西格列汀干预组（SP组，n＝10）：灌胃给予磷酸西格列汀10 mg／（kg· d），溶于2 ml羟甲基淀粉酶中，每日灌胃时间于早9点，持续6周，继续予以普通饲料喂养。

1．4 标本收集与处理T2DM模型造模成功后，所有大鼠禁食12 h，内眦静脉取血2 ml，干预6周后，所有大鼠禁食12 h，称重，10%水合氯醛0．3 ml／100 g腹腔注射，麻醉状态下解剖大鼠，腹主动脉取血3 ml，血标本静止15 min后，3 200 r／min离心10 min，留取血清置于－80℃冰箱保存。并在冰上操作取出肾周脂肪、肝脏组织及股侧肌肉组织，置于液氮罐中以备提取蛋白质。

1．5 指标测定通过测定血清chemerin、体重（body weight，BW）、空腹血糖（fasting glucose，FBG）、胰岛素（fasting insulin，FINS）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL），计算胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，HOMO-IR）［HOMOIR＝FINS（IU／ml）×FBG（mmol／L）／22．5］和胰岛β细胞功能指数（HOMO-β）［HOMO-β＝20×FINS／（FBG-3．5）］来明确西格列汀对各血清代谢指标的影响。

1．6 Western blot法检测组织中chemerin蛋白表达提取肾周脂肪中的总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度决定上样量。依次进行电泳、转膜、封闭，chemerin小鼠抗大鼠单克隆抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜后，辣根酶标记的山羊抗小鼠二抗（1∶4 000）室温下孵育2 h。充分洗涤后ECL化学发光显影并进行胶片显影定影处理。采用上述相同方法，在相同条件下完成肝脏组织及肌肉组织chemerin及各对应的β-actin蛋白检测。图像扫描并分析各条带的灰度值。

1．7 统计学处理采用SPSS 17．0统计软件进行分析，所有数据以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）及LSD法，两样本均数比较采用t检验，相关性分析采用Pearson相关性分析及多元线性回归分析，按α＝0．05检验标准。

2 结果

2．1 干预前各组生化指标的比较与NC组相比，T2DM组与SP组大鼠的BW、FBG、FINS、TC、TG、LDL及HOMO-IR升高，HOMO-β降低，差异均有统计学意义（P＜0．05）；而T2DM组与SP组比较差异无统计学意义。见表1。

2．2 干预后各组生化指标的比较与T2DM组相比，SP组的FBG、FINS、TC、TG、LDL及HOMO-IR均降低，HOMO-β水平升高，差异有统计学意义（P＜ 0．05）；与NC组比较，T2DM组与SP组的FBG、FINS、TC、LDL及HOMO-IR均增高（P＜0．05），BW、HOMO-β水平均降低（P＜0．05），T2DM组的TG增高（P＜0．05），但SP组的TG变化差异无统计学意义。见表2。

表1 西格列汀干预前各生化指标的比较（n＝10，±s）

与NC组比较：*P＜0．05

指标NC组T2DM组SP组F值BW（g）339．70±46．88 382．56±30．51*379．70±44．49*2．37 FBG（mmol／L）5．39±0．8412．74±0．98*12．44±2．28*75．60 FINS（IU／ml）7．10±0．8414．88±2．66*14．65±1．60*56．82 TC（mmol／L）1．78±0．592．71±0．48*2．82±0．62*10．16 TG（mmol／L）0．43±0．071．43±0．44*1．43±0．50*22．23 LDL（mmol／L）0．92±0．302．21±0．27*2．28±0．73*25．45 HOMO-β88．40±36．2232．52±6．60*34．57±7．39*21．37 HOMO-IR1．70±0．348．43±1．63*8．09±1．67*77．70

表2 西格列汀干预后各生化指标比较（n＝10，±s）

与T2DM组比较：*P＜0．05；与NC组比较：＃P＜0．05

指标NC组T2DM组SP组F值BW（g）388．55±39．03 341．50±33．07＃316．80±49．88＃7．79 FBG（mmol／l）5．00±0．8413．36±2．07＃8．09±1．12*＃93．62 FINS（IU／ml）6．45±0．7414．87±2．92＃10．02±0．37*＃64．22 TC（mmol／L）1．70±0．662．76±0．39＃2．07±0．58*＃46．63 TG（mmol／L）0．50±0．151．51±0．30＃0．55±0．03*58．16 LDL（mmol／L）0．90±0．252．22±0．26＃1．37±0．46*＃9．31 HOMO-β90．21±18．7531．08±8．11＃46．54±13．71*＃84．27 HOMO-IR1．44±0．248．88±2．55＃3．61±0．54*＃39．44

2．3 干预前后血清chemerin的比较 与NC组相比，干预前后T2DM组与SP组血清chemerin水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0．05）；干预后与T2DM组相比，SP组血清chemerin水平降低，差异有统计学意义（P＜0．05），同时在SP组组内干预后chemerin水平明显低于干预前，差异有统计学意义（P＜0．05）。见表3。

表3 西格列汀干预前后chemerin水平的比较（pg／ml，n＝10，±s）

与NC组比较：*P＜0．05；与干预后T2DM组比较：＃P＜0．05；与SP组干预前比较：▲P＜0．05

组别干预前干预后NC463．60±39．46493．34±42．65 T2DM587．46±79．87*594．80±73．59*SP592．05±110．39*505．48±41．79*＃▲

2．4 肾周脂肪、肝脏组织及肌肉组织中chemerin蛋白的表达T2DM组与SP组大鼠肾周脂肪、肝脏及肌肉组织的chemerin蛋白表达量较NC组对应组织的表达量增加（P＜0．05），在肾周脂肪及肝脏中表达量最高，但差异无统计学意义；SP组大鼠肾周脂肪、肝脏组织的chemerin蛋白表达量较T2DM组对应组织的表达量减少（P＜0．05），与NC组相比差异无统计学意义，肌肉组织中chemerin的表达量与T2DM相比差异无统计学意义，见图1、表4。

2．5 chemerin与各生化指标的相关性分析 干预前血清chemerin与BW、FBG、FINS、HOMO-IR、TG、TC及LDL呈正相关，干预后血清chemerin与BW、FINS、TG及HOMO-IR呈正相关，见表5。进一步进行多元线性回归分析，干预前以chemerin为因变量，以上述与chemerin有相关性的BW、FBG、FINS、HOMO-IR、TG、TC及LDL为自变量，结果显示BW、TG、FINS及HOMO-IR（R2＝0．604，P＜0．05）可进入回归方程，干预后以chemerin为因变量，以上述与chemerin有相关性的BW、FIN、TG及HOMO-IR为自变量，结果显示TG、FINS、HOMO-IR（R2＝0．375，P＜0．05）可进入回归方程，提示干预前后TG、FINS、HOMO-IR是chemerin的主要影响因素。相关性分析得出血清中chemerin的表达量与肾周脂肪中该蛋白的表达量呈正相关（r＝0．79，P＜0．05）。

3 讨论

在T2DM这种以胰岛素抵抗为主伴有胰岛素分泌相对不足的内环境下，大鼠的胰岛β细胞功能显著降低，伴随血脂及体内脂肪因子chemerin指标的异常，本研究相关性分析得出T2DM组在西格列汀干预前chemerin水平与BW、TG呈独立相关，说明大鼠脂肪细胞数量和体积的增加及伴随而来的甘油三酯异常可能是血清chemerin水平升高的原因；另一方面血清chemerin水平与FINS及HOMO-IR呈独立相关，多项研究［4］证实chemerin与胰岛素抵抗密切相关，如在敲除小鼠chemerin基因后，与野生型小鼠相比，脂肪组织和肝脏胰岛素敏感性降低，肝糖输出增加，GLUT2表达的减少，但也有研究［5］表明chemerin可抑制骨骼肌细胞摄取葡萄糖，降低胰岛素敏感性，诱导细胞产生胰岛素抵抗，结合本实验结果分析，T2DM大鼠血清中FBG、FINS水平的升高与胰岛素抵抗程度增加是刺激chemerin分泌的重要因素。

根据Western blot结果，提示血清中升高的chemerin蛋白可能来源于T2DM大鼠的肌肉、肝脏及脂肪组织，但其中肾周脂肪中蛋白增加的程度要明显大于其余两组织，且血清中chemerin水平只与肾周脂肪蛋白表达量呈正相关，所以血清中升高的chemerin的主要来源于脂肪组织。

西格列汀作为DPP-4抑制剂，可以选择性的抑制DPP-4的生物活性，延迟GLP-1的降解，发挥降低血糖、促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、保护胰岛β细胞功能、促进β细胞再生等作用［6］。除上述作用外，本研究显示西格列汀干预6周后还可改善T2DM大鼠高血脂状态、炎症状态及胰岛素抵抗程度，并且不增加大鼠的体重。

根据相关分析显示在西格列汀干预后chemerin与大鼠的TG、FINS、HOMO-IR成独立相关，这与Derosa et al［7］的研究结果相一致，该实验结果显示联合使用西格列汀的T2DM患者血清chemerin水平、FBG、FINS及HOMO-IR均低于单用二甲双胍组，说明西格列汀可能通过改善胰岛素抵抗和高胰岛素血症来影响chemerin水平。进一步进行Western blot分析，结果显示西格列汀干预后脂肪及肝脏组织中的chemerin表达量降低，提示西格列汀可能通过促进肝脏及脂肪组织细胞胰岛素的信号传递通路中胰岛素受体底物-1（IRS-1）的酪氨酸磷酸化，直接或间接改善胰岛素受体或受体后信号传导途径来增加胰岛素的敏感性，从而影响血清中chemerin水平。另一方面肠道及胰腺分泌的GLP-1、胰岛素和胰高血糖素可以影响TG的水平［8］，而西格列汀可以通过提高GLP-1，降低胰高血糖素，降低肝脏及肠道内载TG脂蛋白的水平来影响TG水平［9］，说明西格列汀能通过调节脂代谢进而影响chemerin的水平。

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The influence of sitaglipin on chemerin levels of type 2 diabetic rats

Liu Jiongjiong，Wang Changjiang，Hu Honglin，et al
（Dept of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the effects of sitagliptin on metabolic parameters and chemerin levels of type 2 diabetic rats，and to explore the relationship between chemerin and type 2 diabetes．Methods A total of 35 male SD rats were randomly divided into normal diet group（NC，n＝10）and a high－fat diet group（HF，n＝25）．After 12 weeks，high-fat diet rats were given an injection of 35 mg／kg streptozotocin at a time，then the diabetic model rats（n＝20）were randomly divided into 2 groups：diabetes control group（T2DM，n＝10）and sitagliptin intervention group（SP，n＝10）．The rats＇metabolic parameters were measured by ELISA．The chemerin protein expression levels in kidney adipose，liver and muscle tissue were detected by Western blot．Results ①The serum chemerin，FBG，FINS，TCH，TG，LDL，HOMO-IR levels of diabetic model group were increased．HOMO-beta decreased．Chemerin expression levels of diabetes control group in adipose，liver and muscle tissue increased compared with NC group；②Sitagliptin could down-regulate the levels of BW，FBG，FINS，TC，TG，LDL，HOMOIR，serum chemerin and chemerin levels in adipose and liver tissues．On the contrary，HOMO-beta was up-regulated；③The correlation analysis showed that TG，FINS and HOMO-IR were always independently associated with chemerin．In tissues，serum chemerin had positive correlation with chemerin expression levels in adipose．Conclusion Sitagliptin can reduce the levels of chemerin in serum and tissues．It also can improve the metabolic indexes remarkably in serum．Chemerin may be a key involving element in the development of diabetes．

type 2 diabetes；sitagliptin；chemerin

R 587．1

A

1000－1492（2015）03－0294－04

2014－11－13接收

安徽省高校省级自然科学研究项目（编号：KJ2013Z126）；安徽中医学院中医药管理局重点学科—中医内分泌学科开放基金（编号：2011nfmxk004）；安徽医科大学第一附属医院2001年度国家自然科学基金青年科学基金培养计划（编号：2011KJ11）

1安徽医科大学第一附属医院内分泌科，合肥 230022

2安徽中医药大学第一附属医院内分泌科，合肥 230031

刘炯炯，女，硕士研究生；王长江，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：chjw82＠126．com；胡红琳，女，副教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：hhlin1994＠sina．com