高产角蛋白酶菌株的筛选、鉴定及其应用研究

陈宇浩　张军儒　徐松鹤

摘要：本实验以乌兰察布市周边各处土壤为样品，筛选出三株具有高效产角蛋白能力的菌株，并进行了形态学、生理生化特性分析和 降解羽毛、兔皮脱毛的比较实验，其中ZY4菌株产酶活力最高，降解羽毛速度最快。

关键词：角蛋白酶；分离筛选；羽毛降解；皮革脱毛

角蛋白（keratin）是一类纤维硬蛋白，具有稳定的化学性质和较高的机械强度，广泛的存在于毛发、鳞羽、蹄角、爪喙及其他的表皮结构中，含有较多的二硫键，通过交联作用使其具有了稳定的结构，一般的蛋白酶（如胰蛋白酶和胃蛋白酶等）无法将其降解[1]。

角蛋白酶（Keratinase）是一类可以特异性降解天然角蛋白的蛋白酶类，主要由细菌、真菌、放线菌产生，大部分为胞外酶。不同种的微生物产生的角蛋白酶性质不同，催化角蛋白分解的机制也有区别[2]。角蛋白酶具有很高的利用价值，可以广泛的应用在饲料的生产、皮革的脱毛等各类工业生产和环境治理方面。

内蒙古乌兰察布市被誉为“草原皮都”，有大量的皮革制品生产销售，需要发展新型的生物酶脱毛技术来减少污染的排放，同时乌兰察布市卓资县的熏鸡产业发达，家禽屠宰数量极大，产生的大量羽毛垃圾需要合理分解。

目前国内对于角蛋白酶产生菌的研究多集中于不同地区高产角蛋白酶菌株的筛选和鉴定，本文旨在从内蒙古乌兰察布市及周边区域筛选出几株高产角蛋白酶的菌株，可以高效的降解角蛋白，从而为乌兰察布市废弃羽毛的利用和皮革脱毛等角蛋白相关工业的生产奠定良好的基础[3]。

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1培养基

富集培养基（g/L）：磷酸二氢钾15g，羽毛粉5g。

初筛培养基（固体）

酪蛋白培养基（g/L）：牛肉膏8g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，NaCl 2g，琼脂20g，磷酸氢二钾18g，干酪素 5g。

脱脂乳粉培养基（g/L）：脱脂奶粉 5g，琼脂粉 20g，二者需分开灭菌。

羽毛粉筛选培养基（g/L）：自制羽毛粉75g，磷酸氢二钾1g，酵母膏1g，琼脂20g，pH75。

兔毛粉筛选培养基（g/L）：兔毛粉5g，磷酸氢二钾1g，NaCl0g，琼脂20g。

NA培养基（g/L）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，Nacl 5g。

1.2 样品采集

乌兰察布市卓资县家禽屠宰场周围的羽毛堆积处，集宁师范学院植物园兔笼周边兔毛堆积处，乌兰察布市前旗幸福村羊圈周边羊毛垃圾堆处分别采集土样。

1.3菌种的筛选及鉴定

1.3.1初筛：取5g土样接入100ml生理盐水中，80℃水浴15min。接种于富集培养基中培养24h后，涂布于干酪素初筛平板培养基，将出现透明圈的单菌落接种于其他种类筛选平板上进行二次筛选，最终挑选在各类平板上均能产生透明圈的菌株编号保藏。

1.3.2复筛：将初筛得到的菌株分别接种到NA培养基中培养，测定各菌株角蛋白酶活性，取酶活性较高的三株菌种分别保存。

1.3.3酶活性测定：角蛋白酶活性的测定参考Gradisar等的方法，以羽毛粉为反应底物，三氯乙酸为催化反应终止剂。于280nm处测定反应液的吸光度。

1.3.4酶活性单位定义：在上述反应条件下，测得的D280nm值每升高001所需要的酶量定义为 1个酶活单位（U）。

1.3.5菌种鉴定

分别观察三株菌株的菌落形态特征，同时观察革兰氏染色特征，生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》。

1.4高产蛋白酶菌株的羽毛分解实验

将三株菌株，以相同的接种量加到放有一只完整羽毛的NA培养基中摇瓶培养，在不同的时间点观察不同菌株对羽毛的降解程度[6]。

1.5高产蛋白酶菌株的兔皮脱毛实验

取大小相同的兔皮分别放入不同种类菌株的培养液中，以不加酶液的皮样作为对照，进行形态学分析，观察脱毛效果。

2.实验结果与分析

2.1菌株的筛选

2.1.1菌株的初筛

通过四种蛋白筛选平板的筛选，得到了11株能产生角蛋白酶并在平板有较大透明圈的菌株，分别编号。

2.1.2菌株的复筛

以角蛋白酶活性为指标进行比较，通过复筛获得 3株角蛋白酶高产菌编号分别为ZY2、ZY4、QY1，酶活性分别为587U/mL、643U/mL、532U/mL。

2.2菌株的鑒定

ZY4菌落颜色为白色，质地均匀，菌落边缘规则，湿润，微透明，菌落正反面形态一致，短杆状菌体，革兰氏阳性芽孢杆菌。QY1菌落呈微黄色，光滑的圆形，质地均匀湿润，边缘不整齐，革兰氏阳性杆菌。

2.3高产蛋白酶菌株的羽毛分解实验

三株菌对羽毛均有降解作用，ZY4菌株作用5天以后其中的羽毛只剩下硬杆，8天后完全降解，降解羽毛的速率最快。

2.4高产蛋白酶菌株的兔皮脱毛实验

QY1菌株作用24h的兔皮脱毛速率最快，表皮脱落后，裸皮粒纹比较清晰。

3.结论

从不同来源的土壤中分离出了3株高产角蛋白酶菌株，综合分析其中ZY4菌株产酶活力最高，降解羽毛速度最快，QY1菌株作用于兔皮脱毛效果最好，本研究表明ZY2、ZY4、QY1是具有高效产角蛋白酶能力的菌株，其16S rDNA分析和工业化的应用有待于深入研究。

参考文献：

[1]杨建强，汤国营.角蛋白酶研究发展[J].生物技术通讯.2005.16（2）：37-42

[2]蔡成岗，郑晓冬.角蛋白酶的来源、理化性质与生物工程研究进展[J].食品与发酵工业，2006，32（4）：111-114.

[3]王政，郭士兵，姚大伟，等.高效降解角蛋白菌株的分离筛选与鉴定