红景天黄酮与血清白蛋白之间相互作用的研究

·论著·

红景天黄酮与血清白蛋白之间相互作用的研究

,韩鹏虎,冷朝阳,芦壮,韩丽琴*(

吉林医药学院药学院，吉林 吉林132013)

摘要：目的探讨红景天总黄酮对牛血清白蛋白(BSA)荧光作用的影响，以及在金属Cu2+存在和不同pH条件下，黄酮对牛血清白蛋白的荧光灭机制。方法测定黄酮、Cu2+离子、不同pH对BSA荧光光谱的影响，并根据所得光谱的变化，判断其对BSA的作用类型。结果随着黄酮溶液用量的增大和Cu2+的加入，BSA的发射波长不变而荧光强度逐渐降低，而随着pH的增加，黄酮与BSA混合液的发射波长不变,而荧光强度逐渐增加。结论总黄酮、Cu2+对BSA有荧光灭作用，并以静态灭作用为主。

关键词：红景天总黄酮；血清白蛋白；金属离子；荧光分光光度法；灭机制

文章编号：1673-2995(2015)06-0431-03

中图分类号：R285.5

基金项目：吉林省教育厅课题(2013476).

作者简介：陆(1972-)，男(满族)，副教授,本科.

收稿日期：(2015-05-18)

The interaction between flavones of Rhodiola and serum albumin

LU Zhao,HAN Penghu,LENG Chaoyang,LU Zhuang,HAN Liqin*(School of Pharmacy,Jilin Medical University,Jilin City,Jilin Province,132013,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of total flavonoids in Rhodiola on bovine serum albumin (BSA) fluorescence and its mechanism in the presence of Cu2+ and with different pH conditions. Methods The effects of flavonoids,Cu2+ and pH on the fluorescence spectra of BSA were determined,and the typification was determined according to the changes of the spectra. ResultsThe emission wavelength of the BSA was invariant and fluorescence intensity was decreased gradually with the flavonoids solution and Cu2+ increased,and with the increase of pH,the emission wavelength of the mixture of flavonoids and BSA were invariant and the fluorescence intensity gradually

通讯作者：韩丽琴(1970-)，女(锡伯族)，教授,硕士.

increased. ConclusionTotal flavonoids,Cu2+have the static quenching effect on BSA.

Key words：total flavone of the total flavonoids;serum albumin;metal ion;fluorescence spectrophotometry;quenching mechanism

红景天是景天科红景天属的多年生草本植物。黄酮作为红景天的有效成分之一，具有明显的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌抗炎症等活性。蛋白质的荧光灭作用分为静态灭和动态灭两种类型。动态灭是荧光体与灭剂由于热运动而发生碰撞引起的[1-3]。静态灭是由于与蛋白质发生了键合作用，通常是产生了不发荧光的配合物，对蛋白质的二级结构产生了影响，从而影响蛋白质的生物活性。本实验测定红景天黄酮与牛血清白蛋白作用的荧光灭光谱，并分析Cu2+存在和不同pH的条件下荧光的变化，以探讨黄酮、金属对血清白蛋白的灭作用机制，为药物的临床推广和新药的开发提供数据。

1　仪器与试剂

红景天黄酮：自制，RF-1501型荧光分光光度计，PHS-3CW微机型酸度计，Tris-HCl缓冲液，其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

2　方法与结果

2.1　总黄酮与BSA之间相互作用

取8个试管，分别加入1 mL 5×10-7mol/L的BSA，再分别加入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL浓度为1×10-4mol/L的黄酮溶液，再分别对应加入缓冲溶液2.6、2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2 mL，静置于25 ℃恒温水浴中8～10 min。扫描BSA在300～460 nm的荧光发射光谱，结果见图1。由图1可知，随着黄酮溶液用量的增大，BSA的发射波长不变而荧光强度逐渐降低，可见，黄酮溶液对BSA有荧光灭作用。

由表1中计算的F0/F对黄酮作图，结果见图2。由图2可以看出，曲线有较好的线性关系，曲线方程为Y=1.114 9X+1.116 9，R2=0.966 7，据文献报道，生物大分子的荧光平均寿命约为10-8s，各类灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞灭常数为2.0×1010L/(mol·s)[3]。根据实验所得Ksv=111 490 L/mol，可以计算出黄酮对BSA的荧光灭常数Kq=1.1×1013L/(mol·s)，远远大于各类灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞灭常数，因此红景天黄酮对BSA的灭作用属于静态灭。

2.2　Cu 2+存在时红景天黄酮与BSA之间相互作用

分别取BSA溶液及黄酮溶液各25 mL，分别混合溶液3 mL于5个试管中，再分别加入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL浓度为1×10-4mol/L的Cu2+溶液，再分别加入缓冲溶液1 mL，同时做试剂空白。激发波长为280 nm，恒温扫描混合溶液在295～500 nm的荧光发射光谱，结果见图3。由图3可知，随着Cu2+的加入，黄酮与BSA混合液的发射波长不变而荧光强度逐渐降低，由此表明Cu2+、黄酮与BSA之间形成了配合物，从而产生了静态灭作用。以动态灭方程F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]处理，结果见表2,[BSA]:5×10-7mol/L；pH=7.40；λex=280 nm。

由表2中计算的F0/F对Na+作图，结果见图4。

由图4可知，曲线有较好的线性关系，曲线方程为Y=1.817 1X+1.147 7，R2=0.976 9，根据实验所得Ksv=181 710 L/mol，可以计算出Cu2+对BSA与黄酮1∶1混合液的荧光灭常数Kq=1.8×1013L/(mol·s)，远远大于各类灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞灭常数，因此Cu2+对BSA与黄酮1∶1混合液的灭作用属于静态灭。

2.3　不同pH时红景天黄酮与BSA之间相互作用

分别取BSA溶液及黄酮溶液各25 mL混合均匀，取制备的混合溶液3 mL于5个试管中，再分别加入pH为1、3、5、9、11、13的溶液各1 mL，同时做试剂空白。恒温扫描混合溶液在295～500 nm的荧光发射光谱，结果见图5。由图5可知，随着pH的增加，黄酮与BSA混合液的发射波长不变而荧光强度逐渐增加，由此表明pH不同影响黄酮与BSA之间形成配合物的荧光强度，影响静态灭的效果。可见，黄酮溶液对BSA有荧光灭作用。

表 1　黄酮对BSA荧光强度的影响

表 2　Cu 2+对BSA与黄酮1∶1混合溶液的荧光强度的影响

图 1　黄酮与BSA的荧光谱图

图 2　F 0/F对黄酮作图

图 3　Cu 2+与[BSA]∶[黄酮溶液]混合液荧光光谱图

图 4　F 0/F对Cu 2+作图

图 5　pH与[BSA]:[黄酮溶液]混合液荧光光谱图

3　讨　论

黄酮与金属Cu2+对牛血清白蛋白(BSA)均具有荧光灭作用，且灭作用类型以静态灭为主。随着黄酮溶液用量的增大，BSA的发射波长不变而荧光强度逐渐降低，随着pH的增加，黄酮与BSA混合液的发射波长不变,而荧光强度逐渐增加，这对研究黄酮的药理作用和生物学效应，以及黄酮对蛋白质构象的影响等提供了重要信息。

参考文献：

[2]张朝红,藏树良,耿兵,等.三丁基锡化合物与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究[J].分析实验室,2006,25(1):36-40.

[3]刘雪峰,夏咏梅,方云,等.三种香豆素类中药小分子与牛血清白蛋白的相互作用[J].化学通报,2004,62(16):1484-1490.