根瘤菌对桔梗幼苗根际土壤微生物种群和酶活性的影响

冀玉良

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000）

根瘤菌对桔梗幼苗根际土壤微生物种群和酶活性的影响

冀玉良

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000）

采用钵盘育苗试验,研究了根瘤菌对桔梗幼苗根际微生物种群和土壤酶活性的影响。结果表明：根瘤菌能显著地调节桔梗幼苗根际土壤微生物种群组成(P＜0.01)，表现出对细菌、真菌和放线菌数量的影响程度明显不同,与对照相比，根瘤菌接种处理28 d后的桔梗幼苗根际土壤细菌和放线菌数量分别增加了40.53%和48.05%,而真菌数量则减少了22.90%，根瘤菌的数量与刚接种时相比增加了190.90%；除了影响根际微生物种群结构外，根瘤菌也能显著提高土壤脲酶、磷酸酶和蔗糖酶的活性(P＜0.01)，与对照相比接种处理28 d后三种酶的活性分别提高了28.80%、25.93%和32.33%。根瘤菌对桔梗幼苗根际微生物和土壤酶活性显著的调节作用在改善土壤微生态环境、提高土壤肥力以及克服桔梗生产连作障碍方面具有一定的应用开发潜力。

根瘤菌；桔梗；土壤微生物；土壤酶活性

桔梗[Platycodon grandiflorum(Jacq．)A．DC]属于桔梗科、桔梗属、桔梗种，为多年生双子叶草本植物，有宣肺、祛痰、利咽、排脓等功能，主治咳嗽痰多、咽喉肿痛等症状，是传统的大宗中药材，需求量大。桔梗根中含有16种以上的氨基酸，包括人体所必需的8种氨基酸，桔梗还含有20多种微量元素，因此其食用价值也很高。但在桔梗生产中常面临着连作障碍问题，表现为病虫害加重，生长缓慢，土壤中矿质元素的平衡状态破坏，最终使其产量下降。作物连作障碍的发生与土壤根际微生态的失调和土壤酶活性的下降密切相关[1－3]。因为土壤根际微生物种群结构改变后会使一些病原菌得以繁殖，土壤酶活性下降会使土壤中一些物质不能被分解，从而导致土壤肥力下降。为了克服作物的连作障碍，人们希望通过在土壤中接入植物促生菌剂的方法来改变土壤的微生态环境，达到消除连作障碍的目的[4－8]。目前在这方面有关生防放线菌和霉菌的研究比较多[9－10]。基于根瘤菌不仅有与豆科植物共生存在的形式，它还有在土壤中自由存在的形式及与其它微生物在土壤中形成联合体的形式[11]，并且近年来在根瘤菌中也发现有解磷、解氨和产植物生长素的活性菌株，人们已把根瘤菌的研究从狭隘的固氮作用扩展到广泛的促生作用。但关于根瘤菌是否能够影响土壤微生物的种群数量，是否对土壤酶活性有调节作用尚未见报道。本研究将通过在桔梗土壤中接种根瘤菌，研究根瘤菌对桔梗根际微生态的调整效应以及对土壤酶活性的调节作用，旨在为研究根瘤菌广泛的促生作用机理提供依据，同时为提高土壤肥力，克服桔梗连作障碍，使桔梗生产走向绿色化积累资料。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试商洛桔梗品种购自商洛市商州区沙河子镇桔梗种植区；供试根瘤菌菌株由本实验室分离提供,根瘤菌菌种先接在YMA斜面培养基,于28℃恒温下培养活化后转接至TY(tryptone－yeast extract)培养液，摇床培养6 d制得菌悬液[12]，备用。

1.2 试验方法

1．2．1桔梗育苗处理

从陕西省商洛市香菊药源基地桔梗种植地采集三年连作桔梗土壤，取土深度为1－10 cm，土壤带回实验室自然风干，用0．5 cm筛子过筛去掉其中的石子和杂质，混匀并用浓度为1%的硫酸调pH成4．5－5．5作苗床土。育苗采用塑料软盘法[10],每孔播种4粒,待出苗后每孔定苗3株,用根瘤菌菌悬液注浇幼苗根际进行处理（根瘤菌菌悬液浓度调成106个细胞/mL）,每孔注浇0．05 mL，以注浇无菌水作对照(CK),每个处理播种4盘（塑料软盘规格参考文献[10]）供不同时期微生物计数和酶活性测定。

1．2．2桔梗根际土壤微生物分离与计数

分别于不同时期（播种0、7、14、21、28 d后）,从盘中取50穴土壤样品并将其混合均匀，采用稀释倒平板法对混匀土样进行细菌、放线菌、真菌和根瘤菌的分离计数，结果换算为每克干土所含微生物的数量（即cfu·g－1干土）[10]。

1．2．3桔梗土壤酶活性的测定

按1．2．2同样方法取土样，按参考文献[13－18]测定土壤脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶和纤维素酶的活性。

1.3 数据处理

实验数据采用Microsoft Excel 2007和SPPS16．0统计软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 根瘤菌在桔梗幼苗根际土壤中的定殖及其

对根际微生物种群数量的影响

图1表示了不同时段根瘤菌在桔梗幼苗根际的定殖分布情况，从图1可以看出，在对照处理的苗床土壤中根瘤菌数量较少,并且在5个不同取样时期测得对照处理的根瘤菌数量变化不大。然而对于接种了根瘤菌的苗床土壤来说，其中的根瘤菌数量明显高于对照处理,并且不同取样时期测得接种处理根瘤菌数量有显著差异(P＜0．01)，桔梗幼苗生长28 d后,接种土壤中的根瘤菌数量较刚播种时增加了190．9%。

根瘤菌对桔梗幼苗根际微生物种群的影响见表1，从表1可以看出，在对照处理和接种处理中细菌的变化皆为随着桔梗幼苗的生长其数量呈现增加的趋势,而且相对于对照接种处理细菌数量的增加有显著的差异(P＜0．01)，接种处理21 d和28 d后，细菌数量分别增加了28．48%和40．53%；桔梗幼苗根际土壤中放线菌数量在对照处理中的变化呈现出先增加而后下降的趋势，在接种处理中表现出随着桔梗幼苗的生长而增加的趋势，相对于对照其增加量具有显著的差异(P＜0．01)。特别是接种处理桔梗幼苗生长21 d和28 d后,幼苗根际土壤放线菌数量分别增加20．64%和48．05%；桔梗幼苗根际土壤中真菌数量在对照处理中的变化呈现出随着桔梗幼苗的生长而增加的趋势，但在接种处理中表现出先增加而后下降的趋势，相对于对照其变化具有显著的差异(P＜0．01)。尤其是接种处理桔梗幼苗生长21 d和28 d后,幼苗根际土壤真菌数量分别降低6．64%和22．90%。上述结果证明,桔梗幼苗根际接种根瘤菌后，根际土壤中各类微生物的数量结构发生了明显的变化，尤其是土壤的微生物类群发生了由真菌型向细菌型的转化。细菌能够促进土壤的矿化，增强土壤的肥力，而真菌的减少在一定程度上对于控制病虫害有利[2]。

图1 根瘤菌在桔梗幼苗根际的定殖分布

表1 根瘤菌对桔梗幼苗根际微生物种群的影响

2.2 根瘤菌对桔梗幼苗根际土壤脲酶活性的影响

接种根瘤菌对土壤脲酶活性的影响如图2所示，从图2可以看出,根际土壤脲酶活性随桔梗幼苗的生长呈现上升的趋势。接种7 d和14 d后根瘤菌接种处理的桔梗根际土壤脲酶活性与对照处理的土壤脲酶活性之间差异不显著。但接种根瘤菌21 d和28 d后的桔梗根际土壤脲酶活性显著高于对照处理的土壤脲酶活性(P＜0．01),与对照相比，接种根瘤菌21 d和28 d后酶活性分别增加了23．81%和28．80%。由此可以发现,根瘤菌在提高桔梗幼苗根际土壤脲酶活性上具有较突出的作用，从而也有利于增加土壤肥力。

图2 根瘤菌对土壤脲酶活性的影响

2.3 根瘤菌对桔梗幼苗根际土壤蔗糖酶活性的影响

土壤蔗糖酶活性的增加，有助于将高分子糖类分解为低分子糖类，为土壤中细菌提供更多的能源，有利于由真菌型土壤向细菌型土壤转化。图3显示了桔梗幼苗根际接种根瘤菌对土壤蔗糖酶活性的影响。从图3可以看出,接种根瘤菌处理的桔梗苗床土壤蔗糖酶活性在不同时期均高于对照处理。桔梗苗床土壤蔗糖酶活性在桔梗播种21 d前呈现上升的趋势,随后开始下降,具有显著性的差异(P＜0．01)。相较于对照处理，播种21 d后接种了根瘤菌处理的桔梗根际土壤蔗糖酶活性提高了30．00%；播种28 d后土壤蔗糖酶活性在接种和对照处理中均明显下降,但接种处理的酶活性还是大于对照32．33%。这说明接种了根瘤菌能够有效地减缓蔗糖酶的活性下降，这对维持细菌生长繁殖是有利的。

图3 根瘤菌对土壤蔗糖酶活性的影响

2.4 根瘤菌对桔梗幼苗根际土壤碱性磷酸酶活性的影响

土壤中磷酸酶的作用是促使有机磷向无机磷的矿化与分解，它是反映土壤磷供应能力的一项重要指标。从图4可以看出,桔梗幼苗根际土壤碱性磷酸酶活性在接种根瘤菌处理与对照处理中的变化趋势基本相似,均表现为先上升再下降然后又上升。但接种根瘤菌处理的酶活性在不同时期均高于对照处理。如播种28 d后，接种根瘤菌处理的土壤中碱性磷酸酶活性与前期相比具有显著性的差异(P＜0．01),磷酸酶活性和对照处理相比也增加了25．93%。这一结果说明，桔梗幼苗根际接入根瘤菌可以在一定程度上提高土壤磷酸酶的活性,从而有利于植物对土壤中磷的吸收。

2.5 根瘤菌对桔梗幼苗根际土壤纤维素酶活性的影响

图5反映了桔梗幼苗根际土壤纤维素酶活性的变化，从图4可以看出，土壤纤维素酶活性在对照处理的桔梗幼苗根际中表现出先随着桔梗生长而上升然后再下降接着又上升的变化趋势,而在接种根瘤菌处理的桔梗幼苗根际土壤中纤维素酶的活性在播种14 d前呈上升趋势,随后呈现下降的趋势，而且变化差异性显著(P＜0．01)。如在接种处理中,同播种14 d处理的土壤纤维素酶活性相比，播种21 d和28 d后桔梗幼苗根际土壤纤维素酶活性分别降低23．81%和28．57%。与对照处理相比，播种21 d和28 d后的土壤纤维素酶活性分别降低了5．88%和16．67%。纤维素酶主要由真菌分泌，纤维素酶活力的降低也从另一方面反映出真菌数量的减少，从而也佐证了接种根瘤菌有利于土壤由真菌型向细菌型转化的结果。

图4 根瘤菌对土壤碱性磷酸酶活性的影响

2.6 土壤酶活性与土壤微生物数量的相关性分析

土壤酶活性与微生物数量之间的相关性分析结果见表2。从表2可以发现，用根瘤菌接种处理的桔梗幼苗根际土壤中的脲酶和土壤蔗糖酶活性与桔梗幼苗根际细菌和根瘤菌数量之间均呈现显著的正相关，与放线菌之间呈现极显著的正相关，与真菌之间的相关性不显著。碱性磷酸酶的活性与细菌、放线菌和根瘤菌数量之间有较大的相关性，但与真菌数量的相关性不大。纤维素酶活性与真菌之间有一定的相关性，但与细菌、放线菌和根瘤菌之间成负相关；对照处理的土壤脲酶活性与真菌之间呈显著的正相关，而与细菌和放线菌之间相关不明显，这可能是因为未接根瘤菌时土壤还未转化为细菌型土壤，其中的细菌还未占优势之故。对照处理的蔗糖酶活性与放线菌之间呈显著正相关，与其它类群之间相关性不大。碱性磷酸酶活性与真菌相关性显著，而与其它类群之间相关性也不大，这可能也是因为未接根瘤菌时土壤中的细菌还未占优势之故。纤维素酶的活性与各种微生物之间有一定的相关性但不明显。

图5 根瘤菌对土壤纤维素酶活性的影响

表2 土壤酶活性与微生物数量的相关性

3 讨论与结论

本研究接入根瘤菌处理后，桔梗幼苗根际细菌和放线菌数量明显提高，而真菌数量明显下降，根瘤菌接种处理28 d后的桔梗幼苗根际土壤细菌和放线菌数量分别增加了40．53%和48．05%,而真菌数量则减少了22．90%,且根瘤菌的数量也与刚接种时相比增加了190．90%。这说明接入根瘤菌使土壤的微生物类群发生了由真菌型向细菌型的转化。许多研究都证明，细菌型土壤有利于促进土壤的矿化，增强土壤的肥力，而真菌型土壤往往容易发生病虫害的连作障碍[9－10]，本研究的结果比同类用其它微生物菌剂接种引起的增加或减少幅度都要大，这说明根瘤菌在克服桔梗的连作障碍上有一定的开发应用潜力。

除了影响根际微生物种群的结构外，本研究揭示出根瘤菌也能显著提高土壤脲酶、磷酸酶和蔗糖酶的活性,与对照相比接种处理28 d后三种酶的活性分别提高了28．80%、25．93%和32．33%。根瘤菌对桔梗幼苗根际土壤酶活性显著的调节作用在改善土壤微生态环境、提高土壤肥力以及克服桔梗生产的连作障碍方面有一定的积极作用。已知土壤酶类参与了土壤中所有的生化反应过程和土壤营养元素的有效化过程，包括腐殖质分解，各种有机物的分解与转化，土壤养分的释放与固定等。土壤酶活性既是土壤生物活性的指示器，又在一定程度上反映着土壤养分的转化动态[19－21]。其中，脲酶能催化酰胺化合物水解为氨，根际土壤中脲酶活性的提高将加速土壤的各类含氮有机物转化为植物可利用的无机物，大大提高根系有效态氮的含量。磷酸酶活性的增加可加速土壤有机磷脱磷速度，促进土壤中有机磷化合物或无机磷酸盐转化成能为植物利用的无机态磷，从而增加土壤磷素的供应水平。根际土壤中蔗糖酶活性的增加为根际微环境提供了必要的碳源营养[22－25]。此外，土壤微生物数量增加，可能会增强与土壤病原菌之间在养分和空间上的竞争，抑制病害的发生。这些都为桔梗创造了良好的生长条件。总之，在桔梗土壤中接种根瘤菌菌悬液，提高了土壤酶活性，增加了土壤养分，增强了土壤的肥力，可以减少化肥的投入，有利于维持生态平衡，对于桔梗的绿色化生产具有重要意义。

近几年一些研究发现根瘤菌中有能够溶磷、解氨和分泌植物生长素的活性菌株，从而将根瘤菌的研究从狭隘的固氮作用扩展到广泛的促生作用。本研究发现的根瘤菌对桔梗根际微生物的种群结构的调整和对土壤酶的活性调节作用将使对根瘤菌促生作用研究的内容更为广泛，当然这方面的研究还有待继续扩展深入，特别是对于根瘤菌接种后的信号传导以及是否对土壤中的病原菌有直接的生防作用尚需进一步研究证实。

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（责任编辑：李堆淑）

Effects of Rhizobium on M icroorganism s and Enzymatic Activities in Rhizosphere Soil During Platycodon Grandiflorum Seedling Stage

JI Yu－liang
（College of Biopharmaceutical and Food Engineering,Shangluo University,Shangluo 726000,Shaanxi）

The effects of rhizobium on enzymatic activities and microbial community in rhizosphere soil of platycodon grandiflorum during seeding stage were studied by using a pot seeding experiment．The results showed that rhizobium could significantly regulate soil microbial community in rhizosphere soil during platycodon grandiflorum seedling stage(P＜0．01),however,it produced different effects on bacteria,actinomycete and fungi．In the 28th day after sowing,the amount of bacteria and actinomycete under inoculation treatment was increased by 40．53%and 48．05%respectively,but the amount of fungi was reduced by 22．90%,compared with those under control treatment;moreover,the amount of rhizobium under inoculation treatment was 190．90%more than that in the sowing day．Besides rhizobium could also improve the activities of urease,phosphatase and invertase(P＜0．01),which were increased by 25．80%,25．93%and 32．33%respectively under inoculation treatment．From the significant role of Rhizobia in regulating rhizosphere microorganisms and soil enzyme activity of platycodon grandiflorum during seedling stage the conclusion can be drawn that rhizobium has a certain application development potential in improving soil micro－ecological environment andimproving soil fertility and overcoming the continuous cropping obstacle of platycodon production．

rhizobium;platycodon grandiflorum;soil microorganism;soil enzymatic activity

S541．9

A

1674－0033（2015）06－0049－06

10．13440/j．slxy．1674－0033．2015．06．012

2015－10－22

商洛学院科研基金项目（13SKY－FWDF004）

冀玉良，男，陕西洛南人，硕士，教授