SP对NE诱导的体外培养大鼠心肌细胞凋亡的影响及机制

马艳霞，孙 韬，郭 政(山西医科大学麻醉学系，太原 03000;山西医科大学第二临床医学院麻醉科;通讯作者，E-mail:maaidushu@sina.com)

心肌缺血是一种常见的中老年疾病，随着生活水平的提高、饮食结构的改变与检测手段的进步，心肌缺血的发病率越来越高，但是其病理生理、分子生物学机制并未完全清楚。在心肌缺血的早期，机体交感-肾上腺素能神经活性增强，血浆儿茶酚胺(CAs)水平升高［1］，同时心肌组织内的SP水平也升高［2］。研究表明，高浓度的NE作用下，可导致体外培养的心肌细胞凋亡率明显升高［3］;作为一种神经肽，SP既能作为神经递质参与信息传递，又能以免疫调节肽及神经源性炎症介质参与体内反应，它还在抗凋亡的过程中发挥作用［3-5］。因此我们设想，急性心肌缺血时NE作为一种损伤因素，而SP可能作为抗损伤因素参与心肌缺血过程。

本实验室最近研究表明，在心肌缺血早期，心肌组织中有热休克蛋白(heat shock protein)B5(HSPB5)的差异表达［6］。HSPB5又称为 αB-晶状体蛋白或 αB-晶体蛋白(αB-crystallin，CRYAB)，它可以作为分子伴侣识别并防止形成不可逆的蛋白质聚集产物;并与多种细胞因子结合发挥抗凋亡作用［7，8］。那么NE引起细胞凋亡的变化是否与CRYAB的变化有关尚无定论。

因此，为探讨NE诱导的心肌细胞凋亡作用及其与CRYAB的关系，SP抗凋亡作用及其与调控CRYAB的关系，本研究主要采用体外培养的心肌细胞模型，以凋亡率、CRYAB表达水平作为主要观察指标，观察 SP对 NE诱导的凋亡的影响及其与CRYAB的关系。

1 材料与方法

1.1 新生大鼠心肌细胞的制备及培养

参照本实验室的方法［9］制备新生大鼠心肌细胞模型。取出生1-3 d的SD大鼠(雌雄不拘，由山西医科大学实验动物中心提供)，无菌操作取出心脏，用1 g/L的无菌胶原酶Ⅱ(W/V，现用现配;Sigma公司，美国)消化，制成细胞悬液，在37℃、含5%CO2的培养箱中孵育70 min，计数后接种于6孔培养板中。采用DMEM培养液(Gibco公司，美国)培养细胞，以5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)抑制非心肌细胞生长。之后每24 h换液一次，72 h后将生长呈亚融合状态且同步搏动良好的心肌细胞用于实验。

1.2 分组及干预

将培养72 h的心肌细胞在无血清的DMEM培养基中平衡1 h后，随机分为对照组、NE组、SP+NE组、D-SP+SP+NE组(D-SP为 SP的特异性NK1受体拮抗剂)。每组3孔。以上各组中，NE、SP、D-SP 终浓度分别为 10-5mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L。对照组不加任何干预药物;NE组仅给予NE(10-5mol/L);SP+NE组先给予SP(10-7mol/L)，孵育15 min后给予NE(10-5mol/L);D-SP+SP+NE组先给予D-SP(10-6mol/L)，孵育15 min后给予SP(10-7mol/L)，再孵育15 min后给予 NE(10-5mol/L)。药物作用3 h后采用流式细胞术(FCM)测定心肌细胞凋亡率的变化，采用Western blot的方法检测CRYAB的表达变化，采用实时荧光定量 real time-PCR(RT-PCR)的方法检测CRYAB的mRNA变化。

1.3 凋亡率的检测

采用细胞凋亡检测试剂盒FITC AnnexinⅤApoptosis Detection KitⅡ (BD PharmingenTM，美国)，严格按照试剂盒说明书进行操作。主要步骤:培养细胞经药物干预相应时点后，吸去上清，加入1 ml不含EDTA的0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美国)于37℃消化3-5 min，加入含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS液终止消化，收集细胞并离心(1 000 r/min，离心5 min)，PBS洗涤后再次离心，用4℃预冷的1×Binding Buffer重悬细胞，并调整细胞密度至约1×106/ml。取100 μl细胞悬液加入5 μl FITC 后再加入5 μl PI，轻轻混匀后室温避光孵育15 min。用1×Binding Buffer稀释至500 μl，1 h 内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 蛋白含量检测

采用Western blot的方法检测CRYAB的含量。主要操作步骤:先提取总蛋白并采用BCA法进行蛋白浓度测定与蛋白定量，Western blot检测步骤参考刘涛［10］的方法并加以改进。根据测定的蛋白浓度计算上样量，每孔上样量中总蛋白含量相同。电泳条件:积层胶60 V，分离胶150 V。蛋白转膜采用PVDF膜(Millipore公司，美国)，封闭液为含5%BSA的封闭液，一抗稀释浓度:CRYAB(Abcam公司，美国)为1∶2 000，GAPDH(Santa Cruz Biotechnology，美国)为1∶500。HRP 二抗(Santa Cruz Biotechnology，美国)浓度为1∶1 500。ECL显影液显影。各蛋白条带的灰度值采用Quantity One图像分析软件分析，用待测蛋白条带与内参GAPDH条带灰度值的比值校正上样误差，并作为蛋白的相对表达量。各组之间蛋白进行比较时，以对照组的蛋白含量作为1，其余各组与对照组的含量比值作为该蛋白的相对表达含量。

1.5 基因检测

采用实时荧光定量real time-PCR(qRT-PCR)的方法检测CRYAB mRNA的相对水平。具体操作步骤参考刘涛［10］的方法并加以改进。采用依次加入TRIzol、预冷氯仿、异丙醇的方法抽提细胞总RNA，之后采用Agilant RNA 6000 Nano和安捷伦2100生物分析仪(Agilent，美国)测定RNA的质量(即完整性，用RIN表示)。采用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生物科技有限公司)反转录合成cDNA后进行cDNA扩增反应，引物序列见表1。按以下参数设置条件进行扩增:95℃2 min，1个循环;95 ℃20 s，61 ℃30 s，68 ℃60 s，40 个循环;95 ℃60 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s，1 个循环。qRT-PCR 结果采用2-ΔΔCt的方法进行分析，各组基因的相对表达量表示为对照组的倍数。

表1 不同基因引物序列Table 1 Primer sequences of different genes

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 细胞凋亡率的比较结果

由表2可见，与对照组比较，NE组凋亡率升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);与NE组比较，SP+NE组凋亡率下降(P＜0.05);与 SP+NE组比较，D-SP+SP+NE组凋亡率升高(P＜0.05)。

表2 不同条件诱导下心肌细胞凋亡率比较结果 (%)Table 2 Comparison of apoptosis rate of myocardial cells treated with different drugs (%)

2.2 不同组CRYAB蛋白含量比较结果

由图1和表3可见，与对照组比较，NE组CRYAB的表达下降，且差异有统计学意义(P＜0.05);与NE组比较，SP+NE组CRYAB的表达升高(P＜0.05);与SP+NE组比较，D-SP+SP+NE组CRYAB的表达下降(P＜0.05)。

图1 Western blot检测不同组别心肌细胞CRYAB的蛋白表达结果Figure 1 Expression of CRYAB protein in myocardiocytes in different groups by Western blot

2.3 不同组别CRYAB mRNA检测结果比较

2.3.1 RNA质量检测 根据Agilent 2100生物分析仪的分析结果，对所提取RNA完整性进行分析，对RIN＞8.0的样本用于实验。本实验中RIN=9.9＞8.0，符合所要求的核酸条件。

2.3.2 CRYAB mRNA的相对水平比较 由表3可见，与对照组比较，NE组CRYAB mRNA的相对水平下降，差异有统计学意义(P＜0.05);与NE组比较，SP+NE组CRYAB mRNA的相对水平升高(P＜0.05);与SP+NE组比较，D-SP+SP+NE组 CRYAB mRNA的相对水平下降(P＜0.05)。

表3 不同组别心肌细胞CRYAB蛋白和m RNA相对含量表达结果比较 (%)Table 3 Com parison of CRYAB protein and mRNA levels in myocardiocytes among different groups(%)

3 讨论

细胞凋亡广泛存在于有机体的生理和病理过程中，是由基因调控的主动有序的细胞自我消亡过程。在高血压、心肌缺血、心肌梗死及心力衰竭等多种心血管疾病的病理过程中均有心肌细胞凋亡参与。凋亡机制复杂，凋亡通路涉及多种细胞因子并接受多种因子的调控。弄清楚各因子在细胞凋亡信号转导过程中的作用并对凋亡的过程进行干预，从而阻止或减少凋亡，对于减轻由于细胞凋亡产生的心脏功能的减退，在多种心血管疾病的治疗中有着重要意义。

多种因素均可以引起心肌细胞的凋亡。1998年Communal等［11］首次应用成年大鼠心肌细胞培养模型，证实NE的毒性效应与心肌细胞凋亡有关。另有研究结果显示NE诱导心肌细胞凋亡的作用呈剂量依赖性［12］。本研究中药物剂量的选择根据本课题组的前期研究结果，利用10-5mol/L NE可以诱导出心肌细胞的凋亡率升高。

SP是一段具有11个氨基酸残基的多肽，是速激肽家族中的一员。SP广泛分布在神经系统和外周组织器官，发挥广泛的生物学作用。如SP可作为神经递质或调质、免疫调节肽、神经源性炎症介质等参与体内神经调节、免疫调节及神经源性炎症反应，并在痛觉调控中发挥重要作用。多项研究［4，5，13，14］表明 SP 还参与细胞的凋亡过程，并发挥抗凋亡作用。本实验室前期研究也观察到SP在心肌细胞中的抗凋亡作用［3］，但是其具体机制尚未完全清楚。本研究根据前期研究结果，选用CRYAB作为观察指标，探讨SP的抗凋亡作用。

αB 晶体蛋白(αB-crystalline protein，CRYAB)属于热休克蛋白家族的一员，在机体各种组织中都有广泛表达。CRYAB最早被发现在受热、渗透压改变、氧化应激等方面具有保护作用，近几年研究发现，CRYAB可以作为抗凋亡的调节因子，保护细胞免受各种刺激(包括星形孢菌素、肿瘤坏死因子、紫外线照射、酸、过氧化氢等)引起的凋亡，同时与某些肿瘤的抗药性及扩散关系密切［15］。CRYAB可以通过多种途径发挥抗凋亡作用。主要途径有:①CRYAB具有强大的分子伴侣作用［16］，可以通过构象改变，产生与蛋白质的结合与释放，从而阻止蛋白质的错误折叠，防止蛋白质的聚集、沉淀与变性。②与各种细胞凋亡调控元件直接作用，阻断凋亡的激活。刘双等［17］研究表明，CRYAB可以通过增加与p53、细胞色素C等促凋亡蛋白结合，减少与抗凋亡蛋白核因子κB结合，从而抑制H2O2诱导的凋亡。③CRYAB可通过抑制Caspase-3的自身水解，从而抑制其活性，最终抑制Caspase-3凋亡途径的激活［18］。

本研究结果表明，NE可以引起体外培养的心肌细胞凋亡率升高，并下调CRYAB编码mRNA与蛋白含量，SP可以拮抗NE引起的凋亡率升高及CRYAB编码mRNA与蛋白含量变化，SP的这一作用可以被其特异性NK1受体拮抗剂D-SP所拮抗。因此我们推测，SP的抗心肌细胞凋亡作用可能是由SP的特异性受体所介导，并通过上调CRYAB的表达实现的。Mao等［19］研究表明，人αA晶体蛋白与αB晶体蛋白可以通过与Bcl-2家族的相互作用起到抗凋亡作用。结合本研究结果，我们推测，SP可能通过与其特异性受体结合后，从基因水平调节CRYAB mRNA的表达，最终影响其蛋白表达，使得更多的抗凋亡蛋白CRYAB与促凋亡蛋白结合，影响凋亡的通路，最终阻断细胞凋亡的下游途径，起到抗凋亡作用。本研究的缺陷在于没有能进一步观察细胞凋亡通路上的关键调节蛋白，如Fas、Bcl-2、Bax等，从而从细胞凋亡的通路水平进一步解释该现象，下一步我们将从细胞凋亡的通路水平进行更深入的研究。

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