泮托拉唑联合枫蓼肠胃康胶囊对乙醇损伤的人胃黏膜上皮GES-1细胞的保护作用

钟洁霞

泮托拉唑联合枫蓼肠胃康胶囊对乙醇损伤的人胃黏膜上皮GES-1细胞的保护作用

钟洁霞①

目的：观察泮托拉唑联合枫蓼肠胃康胶囊对乙醇损伤的人胃黏膜上皮GES-1细胞的保护作用。方法：用不同浓度的乙醇孵育体外培养的人胃黏膜上皮GES-1细胞，于不同的时间段中观察以建立稳定的胃黏膜损伤模型，将泮托拉唑、枫蓼肠胃康胶囊分别配制成不同浓度，MTT法观察两药单独及联用对GES-1细胞的干预。结果：人胃黏膜上皮GES-1细胞在7%的乙醇中孵育3 h细胞抑制率达到40%，是最佳的胃黏膜损伤细胞模型。对GES-1细胞的保护，各浓度泮托拉唑和枫蓼肠胃康胶囊均有一定作用，最佳浓度分别为60 μg/mL和200 μg/mL，两药联用后能够减少药物剂量，且可以提高对胃黏膜的保护作用。结论：泮托拉唑与枫蓼肠胃康胶囊联用后可以提高用药安全，减少用药剂量，在低剂量下即可保护损伤的人胃黏膜上皮GES-1细胞，临床上值得推广。

泮托拉唑； 枫蓼肠胃康胶囊； 人胃黏膜上皮GES-1细胞； 保护

近年来，由于人们饮食、生活越来越没规律，尤其是过量乙醇的摄入，导致胃炎、胃溃疡发病率不断升高，成了临床最常见的疾病之一，严重影响人们的生活质量[1]。泮托拉唑是第三代质子泵抑制剂（PPI），由于其疗效显著，在临床上广泛应用于急性胃黏膜病变、胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病的治疗，但与此同时，其不良反应亦逐渐增多[2]。相关研究报道，泮托拉唑主要不良反应为腹泻、恶心、呕吐、消化不良，甚至存在肌病、血液病、肾病等病例，不良反应与药物剂量存在关系，尤其是对于肝肾功能不全的患者[3]。枫蓼肠胃康由牛耳枫和辣蓼两种药物经过现代工艺提取精制而成，两者配伍升降复常、苦辛并进、寒温并用，使胃肠得和，具有除湿化滞、理气健胃等功效[4]。现代药理研究表明该药能够在胃肠发挥解痉抗炎的作用，有效缓解急慢性胃肠炎症状[5]。笔者通过本研究观察泮托拉唑联合枫蓼肠胃康胶囊对乙醇损伤的人胃黏膜上皮GES-1细胞（简称GES-1细胞）的保护作用，从细胞层面上揭示中西药联用对胃黏膜保护可能的机制[6]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 GES-1细胞由上海信裕生物科技有限公司提供。

1.2 主要试剂 泮托拉唑（商品名：泮立苏，40 mg/片，杭州中美华东制药有限公司，生产批号：140513；枫蓼肠胃康胶囊（0.37 g/粒，海口奇力制药股份有限公司，生产批号：131005）；超敏发光液（北京普利莱基因技术有限公司）；PVDF膜（深圳泰能新材料有限公司）；MTT（广州朗日生物技术有限公司）；培养板、培养瓶等（台州市黄岩方野科技发展有限公司）；胎牛血清、DMEM高糖培养基（武汉博士德生物工程有限公司）；其他试剂为市售分析纯。

1.3 主要仪器 酶标分析仪（上海闪谱生物科技有限公司）；超净工作台（东莞鹏驰净化科技有限公司）；XDS-1B倒置生物显微镜（北京冠普佳科技有限公司）；GL-16G-II型高速冷冻离心机（上海双旭电子有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 GES-1细胞的培养 于标准CO2培养箱中用DMEM高糖培养基（含100 mL/L胎牛血清）常规培养GES-1细胞株2～3 d，约90%满瓶时传代。

1.4.2 GES-1细胞损伤模型的建立 将GES-1细胞用含乙醇的培养液（浓度4%～8%）作用2～5 h，造成GES-1细胞损伤，运用MTT法进行检测，结果最佳细胞模型为细胞抑制率40%左右。

1.4.3 细胞的分组和处理 将实验细胞分为泮托拉唑组、枫蓼肠胃康胶囊组、泮托拉唑联合枫蓼肠胃康胶囊组（联合用药组）、正常组。处理步骤如下：（1）调整细胞密度为5×103/mL，取对数生长期的细胞，接种入96孔板（按照每孔100 uL），常规放置5% CO2、37 ℃的培养箱培养24 h至细胞贴壁后，吸取上清液，运用PBS洗2次。（2）将完全培养基加入正常组GES-1细胞，将筛选出的乙醇浓度加入其余各组，孵育一定时间后，吸取上清液，运用PBS洗2次。（3）于含不同浓度的药物培养基100 μL中加入泮托拉唑组、枫蓼肠胃康胶囊组、联合用药组GES-1细胞，继续培养24 h。

1.4.4 细胞活性的检测 正常组加完全培养基100 μL，泮托拉唑组和枫蓼肠胃康胶囊组分别换上100 μL含不同浓度的泮托拉唑（0、10、20、30、40、50、60、80、100 μg/mL）和枫蓼肠胃康胶囊（0、40、80、120、160、200、240、280、320 μg/mL）的培养液，联合用药组换上100 μL按上述浓度配制的两药联用培养液，每组设5个复孔。各组在培养24 h后，分别加入10 μL 5%MTT，继续培养4 h。吸出培养液，加入100μL DMSO于每个复孔中，振荡10 min使之溶解。运用MTT比色法，用酶标仪以490 nm为测定波长检测吸光度值（OD值），计算细胞活性。

1.5 统计学处理 统计软件采用SPSS 16.0，两组比较采用SNK法，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长情况 正常GES-1细胞在倒置显微镜下观察，细胞之间连接紧密，生长旺盛，中央有圆形核，贴壁呈多边形或菱形等不规则形状生长。乙醇损伤后，大量细胞漂浮于细胞液中，只有少许细胞贴壁，细胞间隙随着乙醇浓度提高或损伤时间增加而变大，连接减少，甚至出现细胞片状脱落，细胞呈椭圆形或圆形状，可见空泡变性，胞质浓缩，细胞核固缩，死亡细胞逐渐增多。

2.2 乙醇致GES-1细胞损伤模型的建立 在各个不同的时间段，各种浓度的乙醇均对细胞有损伤，其中细胞抑制率达到40%是运用7%的乙醇孵育3 h，表明该模型是细胞损伤的最佳模型，如图1所示。

图1 不同孵育时间和不同浓度乙醇对GES-1细胞的抑制率

2.3 各组细胞活性 MTT法显示，泮托拉唑组中，细胞增殖在浓度为0～60 μg/mL时呈剂量依赖性，增值活性在80～100 μg/mL仍存在，但效果不如60 μg/mL时明显，与其他浓度比较差异有统计学意义（P＜0.05），这可能是泮托拉唑剂量过高对细胞产生不良反应，如表1所示。枫蓼肠胃康胶囊组中，细胞增殖在浓度为200 μg/mL的时候最显著，与其他浓度比较差异有统计学意义（P＜0.05），但细胞增殖开始减弱于剂量高于200 μg/mL时，可能是由于药物毒性的作用，见表2。联合用药组细胞与相应浓度的泮托拉唑组和枫蓼肠胃康胶囊组相比，活性均高，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表3。

3 讨论

GES-1细胞来源于胎儿胃黏膜上皮，具有正常人体胃黏膜上皮细胞多种特点，本实验选用该细胞作为细胞模型进行体外实验，在分子水平上接近临床实验[7]。实验采用乙醇诱导胃溃疡模型溃疡发生率高，不用手术，方法简单，结果可靠[8]。本实验MTT法显示细胞抑制率达40%在7%的乙醇孵育3 h的条件下

实现，成功造成胃黏膜细胞损伤模型[9]。

表1 不同浓度泮托拉唑与正常组细胞OD值（±s，n=5）

表1 不同浓度泮托拉唑与正常组细胞OD值（±s，n=5）

*与本组其他浓度比较，P＜0.05

组别OD值正常组1.141±0.111泮托拉唑组0 μg/mL0.641±0.09 10 μg/mL0.759±0.05 20 μg/mL0.778±0.04 30 μg/mL0.851±0.20 40 μg/mL0.881±0.06 50 μg/mL0.971±0.05 60 μg/mL 1.068±0.08*80 μg/mL0.987±0.03 100 μg/mL0.974±0.12

表2 不同浓度枫蓼肠胃康胶囊与正常组细胞OD值（±s，n=5）

表2 不同浓度枫蓼肠胃康胶囊与正常组细胞OD值（±s，n=5）

*与本组其他浓度比较，P＜0.05

组别OD值正常组1.141±0.111枫蓼肠胃康胶囊组0 μg/mL0.658±0.059 40 μg/mL0.731±0.063 80 μg/mL0.771±0.091 120 μg/mL0.921±0.051 160 μg/mL0.952±0.069 200 μg/mL 0.969±0.074*240 μg/mL0.931±0.029 280 μg/mL0.874±0.059 320 μg/mL0.837±0.079

表3 不同浓度联合用药与正常组细胞OD值（±s，n=5）

表3 不同浓度联合用药与正常组细胞OD值（±s，n=5）

*与表1、2中泮托拉唑组和枫蓼肠胃康胶囊组对应浓度比较，P＜0.01

组别OD值正常组1.141±0.111泮托拉唑组联合枫蓼肠胃康胶囊组0+0（μg/mL）0.675±0.064 10+40（μg/mL） 0.831±0.061*20+80（μg/mL） 0.911±0.072*30+120（μg/mL） 0.952±0.731*40+160（μg/mL） 1.043±0.081*50+200（μg/mL） 1.004±0.105*60+240（μg/mL） 0.891±0.044*80+280（μg/mL） 0.861±0.059*100+320（μg/mL） 0.841±0.043*

现代药理学研究表明，枫蓼肠胃康胶囊具有显著的抗炎镇痛双重作用，可迅速缓解腹泻、腹痛、腹胀等临床症状，是治疗胃肠道疾病的有效中成药制剂[10]。泮托拉唑在临床应用上有着其他药不可替代的特点，疗效显著，但随着该药的广泛应用，其不良反应也不断增多，其不良反应涉及包括循环系统、中枢神经系统、消化系统及血液系统等在内的多个器官系统[11-15]。所以，加强对泮托拉唑应用疗程及剂量等研究，辅以中药、中成药联用，减少和避免不良反应的发生，具有重要意义。

本实验将胃溃疡模型的GES-1细胞利用泮托拉唑和枫蓼肠胃康胶囊单独以及联合应用作用，结果表明两组药物均有促进增殖的作用，但随着药物剂量的递增，达到一定程度后对细胞的增殖呈抑制作用。联合用药可以产生协同作用，在减少用药剂量的情况下达到相同的效果，达到减量而增效，保证用药安全。

由于实验条件的限制，本实验无法对胃黏膜bFGF蛋白表达进行分析，对中西药联用保护胃黏膜细胞的机制有待进一步研究。

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Protection of Pantoprazole with Fengliao Changweikang Capsule on Ethanol Damage Human Gastric Epithelial GES-1 Cells Injured by Ethanol/

ZHONG J ie-xia.//Medical Innovation of China，2015，12（08）：004-006

Objective：To Observe the protective effect of pantoprazole capsules with fengliao changweikang on human gastric epithelial GES-1 cells injured ethanol. Method： Human gastric epithelial GES-1 cells were cultured in vitro，incubated with different concentrations of ethanol，and observed at different time periods in order to establish a stable gastric mucosal injury model. Pantoprazole and fengliao changweikang capsules were formulated into different concentrations， MTT were used to observe the GES-1 cells intervention by two drugs alone and in combination.Result：Incubated at 7% ethanol for 3 h， human gastric epithelial GES-1 cells inhibition rate reached 40%， and this was the best model of injured gastric mucosal cell.Each concentration of pantoprazole and fengliao changweikang capsules had a protective effect on the GES-1 cells， the optimum concentration of both drugs were 60 μg/mL and 200 μg/mL， in combination with two drugs could reduce the dose and enhance the protective effect of the gastric mucosa. Conclusion：Combining with pantoprazole and fengliao changweikang capsules can improve medication safety， reduce the dosage， protect human gastric epithelial damage GES-1 cells at low doses，and they are worth promoting in clinical.

Pantoprazole； Fengliao changweikang capsule； Human gastric epithelial GES-1 cells；Protection

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.08.002

2014-11-12） （本文编辑：周亚杰）

①广东省江门市人民医院 广东 江门 529000

钟洁霞

First-author’s address：The People’s Hospital of J iangmen，J iangmen 529000，China