乳杆菌产生的抑酵母活性物质抑菌机理的研究

李海瑄，高鹤尘，陈忠军

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018）

0 引言

酵母菌将食物作为培养基，利用食物中的营养成分进行生长代谢，可以产生多种终产物，并且使食物发生化学、生理及感官特质的变化[1]。因此，研究具有抑制酵母活性的天然防腐剂极为重要。乳杆菌是公认的安全生物，即能改善食品风味，且对其它细菌存在天然的排斥性[2]。

目前对具抑细菌活性乳酸菌的研究工作已经取得了很大的进展，但是对于具抑真菌能力的乳酸菌的研究还处于一个较新的阶段。且对于抑酵母菌活性物质的抑菌作用机理的研究甚少。因此，对筛选出的具有抑酵母菌作用的乳杆菌进行深入研究，揭示其抑菌作用机理具有重大的理论意义，在开发天然食品防腐剂及其利用方面具有广阔的前景。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌株

实验菌：ALAC-3、ALAC-4，从内蒙古传统发酵食品中分离得到的乳杆菌。

指示菌：白假丝酵母（Candida albicans），中国微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

乳杆菌培养基：MRS培养基；指示菌培养基：YEPD培养基；抑菌活性检测培养基：水琼脂培养，TSB培养基配制方法见参考文献[3-4]。

1.1.3 试剂

牛肉膏，大豆蛋白胨，胰蛋白胨，酵母提取粉，葡萄糖，吐温80，柠檬酸铵，乙酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸锰，磷酸二氢钾，氯化钠，柠檬酸氢二铵，Agar，硫酸铵（分析纯），无水甲醇，蒽酮，硫脲，三氯乙酸，钼酸铵，冰乙酸，硫酸亚铁，硫酸，盐酸，磷酸，Trizma base，SDS，TEMED，Acrylamide，β-Mercaptoethanol考马斯亮蓝R-250等。

1.1.4 仪器

FLC-3型超净工作台，HVE-50型全自动高压灭菌锅，SPX-1500型恒温恒湿培养箱，BCD-245D型冰箱，12001型电子天平，HM-12型pH计，L600型低速自动平衡离心机，RE-52AA型旋转蒸发器，T6新世纪紫外可见分光光度计，JY 88-IIN型超声波细胞粉碎机，JC-TS-2型脱色摇床，BG系列垂直电泳装置，BIO-RAD凝胶成像仪等。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及抑菌物浓缩液的制备

将半固体穿刺保存的乳杆菌菌株接种到MRS液体培养基中活化一代（37℃，16～24 h），将第一代发酵液离心（3 000 r/min，10 min），取上清液。再用旋转蒸发器对上清液进行浓缩至25倍，得到抑菌物质浓缩液。

1.2.2 抑菌物质粗提液的制备

用硫酸铵沉淀法对抑菌物质浓缩液进行粗提，硫酸铵溶液的饱和度为40%[5]，得到含蛋白质沉淀的粗提物。用蒸馏水配制成不同质量浓度的粗提液，质量浓度分别为0.05，0.5，2，4 g/mL，放入-20 ℃冰箱中备用。

1.2.3 指示菌的活化

将酵母菌从斜面保藏中用灭菌后的接种环挑入YEPD液体培养基中活化一代（30℃，36～48h），再接种到YEPD液体培养基内传两代培养（30℃，36～48 h），将第二代的菌株留下备用。

1.2.4 抑菌物质对酵母菌生长曲线的影响

在5mL灭菌后的YEPD液体培养基中同时加入0.1 mL酵母菌液和0.1 mL质量浓度为4 g/mL抑菌物质粗提液，以加等量无菌水作为空白对照，30℃分别处理0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36 h后在600 nm处测吸光值，平行三次[6]。

1.2.5 抑菌物质对酵母菌液中可溶性总糖质量浓度的影响

（1）葡萄糖标准曲线的绘制。精确称取葡萄糖0.100 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，得质量浓度为1.0 g/L的葡萄糖标准溶液。精确量取标准溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于不同试管中，再分别加入蒸馏水至总体积为1.0 mL，摇匀后分别加入2 mL蒽酮试剂，混匀冷却后置于沸水浴中加热7 min，取出冷却至室温，在暗处放置10 min，以空白管为对照，在波长为620 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度作为横坐标，以吸光度作为纵坐标，绘制标准曲线[7]。

（2）样品总糖的测定。取0.2 mL酵母菌液至10 mL灭菌的生理盐水中，并用混匀器混匀，分别加入0.5 mL不同质量浓度抑菌物质粗提液，以加等量无菌水作为空白对照，30 ℃分别处理0，2，6，10，24 h后取出1 mL于离心管，离心（4 000 r/min，10 min）取上清液，在上清液中加入2 mL蒽酮试剂，混匀冷却后置于沸水浴中加热7 min，取出冷却至室温，在暗处放置10 min，在波长为620 nm处测定吸光度，平行三次。从标准曲线中查得相应的总糖质量浓度[8]。

1.2.6 抑菌物质对酵母菌液中菌体磷代谢的影响

将酵母菌以2%的接种量扩培至50 mL的YEPD液体培养基中，在30℃培养12 h后离心（4 000 r/min，5 min）弃去上清液，沉淀加入5 mL浓度为1 mg/mL葡萄糖溶液和1 mL浓度为0.04 mg/mL磷标准液，分别加入0.3 mL不同浓度抑菌物质粗提液，以加等量无菌水作为空白对照，混匀后30℃分别处理0，2，6，10，24 h后取出1 mL于离心管，加入5 mL三氯乙酸-硫酸亚铁溶液，放置10 min，离心（4 000 r/min，5 min）取上清液于试管中，加0.5 mL钼酸铵溶液，混匀后30℃恒温水浴15 min，冷却后在波长为630 nm处测定吸光度，平行三次[9]。

1.2.7 抑菌物质对于酵母菌体蛋白表达的影响

在50 mL的YEPD液体培养基中同时加入1 mL酵母菌液和1 mL质量浓度为4 g/mL抑菌物质粗提液，以加入等体积无菌水作为空白对照，混匀后30℃分别处理4，8，12，24 h后取出，离心（4 ℃，6 000 r/min，10 min）弃上清，在菌泥中加入5 mL灭菌生理盐水，混匀后离心（4℃，6 000 r/min，10 min）弃上清，如此洗涤3次后，加3 mL灭菌生理盐水，用超声波细胞粉碎机进行酵母细胞破壁30 min（工作10 s，间歇5 s，功率16%）后离心（4 ℃，6 000 r/min，10 min），去上清液，加80 L无菌水混匀，按体积比1∶3加入样品缓冲液，混匀后于沸水浴中煮沸5 min，取20 L，在12%的分离胶和5%的浓缩胶，稳定电压100 V不变的条件下进行SDS-PAGE电泳，当溴酚蓝下行到距胶末端1 cm处时，即可停止电泳。

凝胶取出后，浸入考马斯亮蓝R-250染色液中，在摇床上室温下染色过夜。染色到时后，用蒸馏水冲洗去表面的染料，浸入脱色液中，在70℃电热鼓风干燥箱中脱色，要经常更换脱色液，直至条带清晰为止。利用BIO-RAD凝胶成像仪得到清晰的凝胶图像[10-11]。

2 结果与分析

2.1 抑菌物质对酵母菌生长曲线的影响

按照1.2.4的方法将两株菌产生的抑菌物质分别与酵母菌菌悬液混合处理不同时间后，测定其吸光度，结果如图1所示。

在适宜生长条件下，菌体生长出现4个阶段：延滞期、对数期、稳定期以及衰亡期[6]。由图1可以看出，空白对照是酵母菌在30℃时正常的生长曲线，其中，0～6 h为延滞期，6～20 h为对数生长期，20～36 h为稳定期。加入抑菌物质后，酵母菌的生长受到影响，同样的生长时间的OD值均低于空白对照，对数生长期缩短，菌体生物量下降；加入ALAC-4所产抑菌物质的酵母菌受到更大的影响，说明菌株ALAC-4对酵母菌生长的影响强于菌株ALAC-3。

图1 抑菌物质粗提液对酵母菌生长曲线的影响

2.2 抑菌物质对酵母菌液中可溶性总糖的影响

2.2.1 葡萄糖标准曲线

按照1.2.5（1）的方法绘制葡萄糖标准曲线，结果如图2所示。根据图2，可得其线性回归方程为y=10.044x+0.0206，其中R2=0.9919（＞0.99）。

图2 葡萄糖标准曲线

2.2.2 抑菌物质对酵母菌液中可溶性总糖的影响

糖与硫酸混合后，在沸水浴中加热，使糖脱水，然后再与蒽酮缩合生成蓝绿色化合物，其颜色的强弱与溶液中糖的质量浓度成正比[12]。

按照1.2.5（2）的方法将两株菌所产抑菌物质分别与酵母菌菌悬液混合处理不同时间后，测定其吸光度。根据所得标准曲线得出可溶性总糖质量浓度，结果如图3和图4所示。

图3 ALAC-3产抑菌物质对酵母菌菌悬液中可溶性总糖的影响

图4 ALAC-4产抑菌物质对酵母菌菌悬液中可溶性总糖的影响

由图中可以看出，随着处理时间的延长，空白对照中的可溶性总糖质量浓度基本不变。对于菌株ALAC-3（见图3），经不同质量浓度粗提液处理处理酵母菌后，可溶性总糖质量浓度先升高，表明此时酵母菌细胞膜通透性被改变，使胞内糖类物质外渗。当质量浓度为0.05 g/mL时，可溶性总糖质量浓度在2～6 h时明显降低，说明此浓度抑菌物质的抑菌性较弱，能进行正常生命活动的酵母菌较多，利用较多糖类物质；当质量浓度为0.5 g/mL时，可溶性总糖质量浓度在10 h后明显降低；当质量浓度为2 g/mL和4 g/mL时，10 h后降低的程度较小，说明此浓度时酵母菌已完全受到影响，不能再利用菌液中的糖类物质进行生命活动。由此可知粗提液浓度越高，抑菌性越强，对酵母菌细胞膜的影响越大。

对于菌株ALAC-4（见图4），当质量浓度为0.05 g/mL时，在10 h时明显下降；当质量浓度为0.5 g/mL时，可溶性总糖质量浓度在2 h时明显增大，在10 h时明显下降；当质量浓度为4 g/mL时，变化基本不大，可能是因为浓度很高，刚处理时酵母菌就完全受到影响，不能再利用菌液中的糖类物质进行生命活动。且通过对比可以看出菌株ALAC-4对酵母菌菌悬液可溶性总糖的影响大于菌株ALAC-3，即菌株ALAC-4对酵母细胞膜通透性的影响强于菌株ALAC-3，这一结论与上述测得生长曲线的结论均一致。

2.3 抑菌物质对酵母菌体磷代谢的影响

磷是所有包括微生物在内的生物所需要的微量元素，它是核酸、磷脂以及糖代谢中间产物的重要组成成分，而且在细胞的能量代谢中起到十分关键的作用[8]。

微生物利用葡萄糖经过一系列磷酸化反应过程，是微生物生长繁殖所需能量的主要途径。通过测定微生物细胞代谢活动时磷的消耗情况能够反映微生物细胞的整体代谢功能及其生长情况[13]。

按照1.2.6的方法将两株菌所产抑菌物质分别与酵母菌菌悬液混合处理不同时间后，测定其吸光度。结果如图5和图6所示。

由图可以看出，随着处理时间的延长，空白对照呈明显的下降趋势，表明正常的酵母菌消耗了实验前所添加的磷，对磷进行正常的代谢活动。对于菌株ALAC-3（图5），当质量浓度为0.0 5g/mL时，0～10 h与空白对照几乎一致，在10 h时达到最低值，之后趋于稳定，表明此时抑菌物对酵母菌的磷代谢造成一定影响。当质量浓度为0.5 g/mL时，0～2 h磷质量浓度迅速下降，进行正常的磷代谢。2～6 h磷质量浓度几乎不变，表明此时抑菌物质使酵母菌不能正常的利用磷进行生命活动。6～10 h磷质量浓度降低，表明有未收到影响或受影响不大的酵母菌仍能利用磷进行代谢。之后略有上升，原因可能是之前受到影响的酵母菌细胞裂解，使其自身含有的磷解离出来。当质量浓度为2 g/mL时，0～6 h磷质量浓度呈下降趋势，6 h达到最低，在此期间酵母菌利用磷进行正常的代谢活动。之后磷质量浓度上升，10 h后趋于稳定，原因可能是受到影响的酵母菌细胞裂解，使其自身含有的磷解离出来，使磷质量浓度增加，之后抑菌物质的抑菌性有所降低，不再能使酵母菌破裂解离出磷。当质量浓度为4 g/mL时，0～2 h磷质量浓度下降，进行正常的磷代谢。之后缓慢上升，24 h达到最大，原因与上述相同。由此可知粗提液浓度越高，抑菌性越强，对酵母菌磷代谢的影响越大。

图5 ALAC-3产抑菌物质对酵母菌菌体磷代谢的影响

图6 ALAC-4产抑菌物质对酵母菌菌体磷代谢的影响

对于菌株ALAC-4（图6），当质量浓度为0.05 g/mL时，与空白对照几乎一致，在10h时达到最低值，之后趋于稳定；当质量浓度为0.5 g/mL时，0～6 h磷质量浓度基本稳定，之后上升，10 h达到最大后趋于稳定；当质量浓度为2 g/mL时，0～2 h磷质量浓度有所下降，酵母菌利用磷进行代谢活动，之后迅速上升，6 h达到最高，之后趋于稳定；当质量浓度为4 g/mL时，0～10 h磷质量浓度一直在上升，10 h达到最高后趋于稳定，此浓度时抑菌物质对酵母菌磷代谢的影响最大。

由图可知，当质量浓度为0.5 g/mL时，菌株ALAC-3抑菌物质处理酵母10 h时后，磷质量浓度才开始趋于稳定，酵母菌不再利用磷进行正常的代谢活动，影响酵母菌的磷代谢。而菌株ALAC-4抑菌物质在0～6 h就影响了酵母菌的磷代谢。当质量浓度为2 g/mL时，菌株ALAC-3抑菌物质处理酵母6 h之后才影响酵母菌磷代谢，而菌株ALAC-4抑菌物质在2 h后就已经开始影响酵母菌磷代谢。当质量浓度为4 g/mL时，菌株ALAC-3抑菌物质处理酵母2 h之后才影响酵母菌磷代谢，而菌株ALAC-4抑菌物质在一开始就已经影响酵母菌磷代谢。因此可以说明菌株ALAC-4所产抑菌物质对酵母菌磷代谢的影响明显强于菌株ALAC-3。

2.4 抑菌物质对酵母菌蛋白质表达的影响

按照1.2.7的方法将两株菌所产抑菌物质分别与酵母菌菌悬液混合处理不同时间后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图7和8所示。

图7 ALAC-3产抑菌物质对酵母菌蛋白质表达的影响

图7中，M为标准分子量蛋白#26614；1为ALAC-3抑菌物质粗提液；2为未加抑菌物质粗提液的酵母菌；3～6为经抑菌物质粗提液处理4，8，12，24 h。

由图7可以看出，经ALAC-3抑菌物质粗提液处理后，酵母菌蛋白质表达受到影响。处理8，12和24 h时，所有条带均比前一个时间处理略变浅，且A，B，C处条带明显变浅，其分子量大约是50，30，20 ku。

图8 ALAC-4产抑菌物质对酵母菌蛋白质表达的影响

图8中，M为标准分子量蛋白#26614；1为ALAC-4抑菌物质粗提液；2为未加抑菌物质粗提液的酵母菌；3-6为经抑菌物质粗提液处理4，8，12，24 h。

从图8可以看出，经ALAC-4抑菌物质粗提液处理后，酵母菌蛋白质表达受到较大的影响。处理8h时，所有条带颜色均略变浅；处理12 h和24 h时，所有条带均明显变浅，A（约70 ku），B（约50 ku），C（约48 ku），I（约20 ku）处条带几乎消失，还出现了空白对照中不存在的特异条带G（约25 ku）。

由此可知，与空白对照相比，加入抑菌物质后酵母菌的蛋白质表达均受到不同程度的影响，处理时间越长，受到的影响就越大。且经ALAC-3抑菌物质粗提液处理后，酵母菌蛋白质表达受到的影响较小。而经ALAC-4抑菌物质粗提液处理后，酵母菌蛋白质表达受到的影响则较大。说明来自于菌株ALAC-4的抑菌物质对酵母菌蛋白质表达的影响更强。

3 结论

两株乳杆菌产生的抑菌物质对酵母菌生长曲线有一定影响，对数生长期缩短，菌体生物量下降；抑菌物质能使酵母菌体内可溶性总糖外渗，导致菌液中可溶性总糖质量浓度增加，从而说明其改变了酵母细胞膜的通透性；且抑菌物质使酵母菌无法正常进行磷代谢，无法正常进行蛋白质表达，导致蛋白质缺失或含量下降，从而影响酵母菌生长和繁殖，达到抑菌的目的。

以上结果表明，乳杆菌产生的抑酵母活性物质对酵母菌生长曲线、细胞膜通透性、磷代谢和蛋白质表达均有影响，导致酵母菌无法正常进行生长和繁殖，从而产生抑菌作用。且来自于ALAC-4的抑菌物质的抑菌性更强。

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