行为学研究乳清蛋白肽对衰老小鼠学习记忆的影响

齐微微，卞辑，蔡兴航，郭佩佩，王艳菲，姚宇秀，于国萍

（东北农业大学食品学院，哈尔滨150030）

0 引言

近年来人们对乳清蛋白肽[1]的研究逐渐成为热点，目前已发现某些肽段具有抗氧化，降血压[2]，降胆固醇，增强免疫力，抗毒，抗病菌[3]等多种生理功能，E.A.Pera-Ramos等研究发现乳清蛋白酶解物在脂质氧化体系中可以防止脂质过氧化[4]。Tugba Bayr[5]等酶解乳清蛋白，研究了其自由基清除能力，发现乳清蛋白肽具有良好的抗氧化活性；包怡红等[6]证实以全乳清为原料，利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行降解，水解后的多肽对Fenion体系产生的羟自由基有清除能力。目前已经证实乳清蛋白肽能够清除自由基[7]，延缓机体衰老，因而可能也具有改善学习记忆的作用，但研究并不多见。本实验选择抗氧化活性最强的乳清蛋白肽的超滤组分进行动物行为学实验，研究乳清蛋白肽对衰老小鼠学习记忆能力的影响。

1 实验

1.1 材料与试剂

浓缩乳清蛋白（WPC 80），蛋白质质量分数78.29%，碱性蛋白酶（1.75×105U/g），昆明种雌雄小鼠，吡拉西坦（脑复康，0.4 g×100片），其余所有试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

UVmini-1240紫外可见分光光度计，LD4-2A型低速离心机，万能粉碎机，RE-52型旋转蒸发仪，DSM-2型Morris水迷宫系统与SCS-2型程控小鼠穿梭箱，DT-200小鼠跳台测试仪。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白抗氧化肽的制备

乳清蛋白肽的制备参考卞辑的方法[8],以DPPH自由基清除率为指标，对乳清蛋白肽进行脱盐、超滤分离，筛选出抗氧化活性最高的组分（分子量小于3 ku），将其冷冻干燥成粉末，以备下一步实验。

1.3.2 动物行为学实验

1.3.2.1 实验动物饲养及分组

动物饲养：取雌雄昆明种小鼠80只，购买自然衰老的老年小鼠16～18月龄，青年小鼠3月龄，体重20.0g±2.0 g，适应性饲养1周后，用Morris水迷宫系统筛选，剔除漂在水面上的小鼠，剩余72只。随机分组（见表1），每组雌雄小鼠数目相等，分为青年对照组，老年模型组，脑复康对照组和乳清蛋白肽低、中、高剂量组，分笼饲养，雌雄不同笼。每组12只，每5天称1次体质量，老年模型组和青年对照组每天注射等量生理盐水。低、中、高剂量组注射的乳清蛋白肽溶液是由超滤分离出的分子量小于3 ku的寡肽冻干粉配制而成。

表1 动物实验分组方案

1.3.2.2 行为学实验

连续喂养30 d后，于第31天按照跳台实验、穿梭箱实验、水迷宫实验的顺序依次开始行为学实验。

（1）跳台实验[9]。实验时先将小鼠放入反应箱内（台上、台下）适应环境3 min，然后将其放在铜栅上，立即通以36 V的交流电，观察小鼠受到电击跳回平台以及再次跳至铜栅上的情况。如此训练5 min，记录每只小鼠受电击的次数或称错误次数（EN1），以此作为学习成绩。24 h后和5 d后分别进行重复测验，将小鼠置于平台上，记录各鼠第一次跳下平台的时间，即停留潜伏期（step-down latency，SDL）和各鼠3 min内的错误次数（EN1），以此作为记忆成绩。停止实验5d后再进行1次重复实验，记录上述指标，作为记忆消退阶段的成绩。

（2）穿梭箱实验[10-11]。实验时将小鼠放入穿梭箱内任何一侧，10 s后开始出现蜂鸣音，持续5 s，蜂鸣音后给予电刺激（100 V，0.2 mA，50 Hz，AC），持续10 s。连续训练4 d，每天10次。记录以下指标：电击时间，即动物被电击的累计时间；电击次数，即在10个循环中小鼠被电击到的次数。

（3）Morris水迷宫实验[12-13]。实验时将平台随机置于第一象限并固定于水下1～1.5 cm，水温保持在21℃±1℃。整个实验过程分为定位航行实验和空间探索实验两部分。

①定位航行实验：用于测量小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力，实验历时6 d，每天训练4次。在距离平台所在象限的较远象限的水池壁上标定一点，作为实验小鼠的入水点，实验过程保持站台位置和小鼠落水位置不变。将小鼠沿水池壁慢慢放入水中，通过Dig Behv-MWM视频分析系统记录小鼠从投入水池至找到并爬上平台的时间，此为定向航行实验逃逸潜伏期，同时记录游泳路程、游泳速度和朝向角，以此作为评价大鼠学习能力差异的指标，每次观察时间为90 s，若设定时间内未找到站台，计算机停止跟踪，记录时间为90 s，然后通过引导使小鼠游上平台并停留5s。每次试验均在安静的环境中进行，水池和光源的位置应保持不变。

②空间探索实验：用于测量小鼠对平台空间位置的记忆保持能力，方法为第七天撤去平台，以训练时的标定点作为入水点，将小鼠放入水中，记录120 s内小鼠在目标象限（平台所在象限）的停留时间、目标象限停留路程、准确穿越平台所在位置的次数及初次穿越平台时间等指标，作为空间搜索试验的成绩，以此来判断小鼠对空间位置的短期记忆和判断能力。

1.4 统计分析

文中数据均使用SPSS18.0软件进行统计分析，所用数据均为三次的平均数，误差项为标准误，单因素方差分析（ANOVA）中采用Duncan检验。文中采用Sigma Plot 9.0软件作图，图表中标有相同字母者为差异不显著，有不同字母者为差异显著（P≤0.05）。

2 结果与分析

2.1 跳台实验测试结果

表2为乳清蛋白肽对跳台潜伏期和跳台错误次数的影响。由表2可以看出，与老年模型组相比，学习5 min后，青年对照组、脑复康对照组和乳清蛋白肽剂量组错误次数显著减少；24 h后重复测验结果显示，乳清蛋白肽中、高剂量组的潜伏期显著增加，错误次数显著减少，乳清蛋白肽低剂量组的潜伏期无显著变化，错误次数显著减少；5 d后重复测验结果显示，乳清蛋白肽中、高剂量组的潜伏期和错误次数变化与24 h相同，而低剂量组的潜伏期和错误次数均无显著变化。与青年对照组和脑复康对照组相比，学习5 min后，乳清蛋白肽剂量组的错误次数显著增加；24 h后重复测验结果显示，乳清蛋白肽剂量组的潜伏期显著减少，错误次数显著增加；5 d后重复测验结果与24 h变化规律一样。

表2 乳清蛋白肽对跳台潜伏期和跳台错误次数的影响（n=10）

结果表明中、高剂量组乳清蛋白肽可以提高衰老小鼠的被动回避反应能力，高剂量组效果最好，低剂量组的效果不明显。

2.2 避暗实验测试结果

图1 乳清蛋白肽对电击时间和电击次数的影响

图1为乳清蛋白肽对电击时间和电击次数的影响。由图1可以看出，随着训练天数的增加，各组小鼠的电击时间和电击次数均显著减少，说明小鼠的躲避能力有所增强；采用Duncan法对各组的指标进行两两比较发现，与老年模型组相比，青年对照组、脑复康对照组和乳清蛋白肽中、高剂量组的电击时间和电击次数均显著减少，乳清蛋白肽低剂量组的电击时间也显著减少，但电击次数无显著变化；与此同时，与青年对照组和脑复康对照组相比，乳清蛋白肽剂量组的电击时间和电击次数均显著增加。说明一定剂量的乳清蛋白肽虽可以提高衰老小鼠的避暗能力，但与青年和脑复康对照组相比还有一定差距。

2.3 水迷宫实验测试结果

2.3.1 定位航行实验

图2为乳清蛋白肽对水迷宫逃避潜伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角的影响。

由图2可以看出，时间与组间无交互作用；随着训练天数的增加，各组动物的逃避潜伏期、游泳路程和朝向角均显著减少，游泳速度显著增加，说明经过6天训练，小鼠的学习能力均有不同程度的增强。采用Duncan法对各组的指标进行两两比较发现，随着训练天数的增加，与老年模型组相比，青年对照组、脑复康对照组和乳清蛋白肽剂量组的逃避潜伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角显著减少；但分别与青年对照组和脑复康对照组相比，乳清蛋白肽剂量组的逃避潜伏期、游泳路程仍有显著增加，游泳速度和朝向角虽然个别数值有些波动，但整体趋势有所增加，且各组之间均存在显著性差异。说明乳清蛋白肽在一定程度上能够改善衰老小鼠的学习能力。

2.3.2 空间探索实验

实验第7天，撤去平台后进行空间探索实验，结果如表3所示。由表3可以看出，与老年模型组相比，青年对照组、脑复康对照组和乳清蛋白肽剂量组在目标象限停留时间、时间百分比、路程百分比、经过平台次数均显著增加；初次穿越平台的时间显著减少；乳清蛋白肽低、中剂量组在目标象限停留路程增加；青年对照组、脑复康对照组和乳清蛋白肽高剂量组在目标象限停留路程减少；分别与青年对照组以及脑复康对照组相比，乳清蛋白肽剂量组在目标象限停留时间、时间百分比、路程百分比、经过平台次数显著减少；目标象限停留路程、初次穿越平台的时间显著增加；且各组之间均存在显著性差异，与乳清蛋白肽呈良好的量效关系，说明乳清蛋白肽能够改善衰老小鼠的空间记忆能力。

2.3.3 水迷宫游泳轨迹类型

搜索策略是衡量动物分析判断能力和解决问题能力的指标。水迷宫游泳轨迹如图3所示，图3中，小鼠的搜索策略随着训练次数的增加而呈现“边缘式→随机式→趋向式→直线式”的变化规律，学习记忆能力好的小鼠，经过3～5 d的训练，其搜索策略以趋向式和直线式为主（统称为空间策略），而较差的则以边缘式和随机式为主。

表3 乳清蛋白肽对第7天空间探索实验的影响 （n=10）

图2 对水迷宫逃避潜伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角的影响

在定位航行与空间探索实验中，每组10只小鼠，共游泳280次，搜索策略结果显示（表4），老年模型组游泳轨迹以随机型和边缘型为主，共188次，说明需要较长时间和游泳路程才能找到平台；与老年模型组相比，青年对照组、脑复康对照组和乳清蛋白肽剂量组的趋向型和直线型轨迹总数有所增加；分别与青年对照组相比以及与脑复康对照组相比，乳清蛋白肽低、中剂量组的趋向型和直线型轨迹总数有所减少，乳清蛋白肽高剂量组的趋向型和直线型轨迹总数有所增加，说明衰老小鼠的空间学习和记忆保持能力得到明显改善。这可能是由于乳清蛋白肽具有抗氧化活性，可以清除脑内自由基，阻止脂质过氧化反应的发生，降低过氧化物的生成，从而延缓大脑的衰老，对学习记忆力具有一定改善作用。

图3 水迷宫游泳轨迹

表4 乳清蛋白肽对水迷宫游泳轨迹的影响

3 结论

在跳台和穿梭箱实验中，乳清蛋白肽灌胃后可以增加衰老小鼠跳台潜伏期和减少跳台错误次数，减小电击时间和电击次数，其中中、高剂量组效果显著；在水迷宫实验中，从整体趋势上看，乳清蛋白肽灌胃后可以减少定位航行实验中衰老小鼠的逃避潜伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角，增加空间探索实验中的目标象限停留时间、目标象限停留时间百分比、目标象限停留路程百分比、经过平台次数和减少初次穿越平台的时间，同时游泳轨迹也向趋向型和直线型发展，可见乳清蛋白肽能够提高衰老小鼠的被动回避和空间学习记忆能力。

但是本研究制备的乳清蛋白抗氧化肽对行为学的影响目前仍不如脑复康等西药，与青年小鼠相比也尚存在一定差距，也许可以通过改进制备方式纯化方法等，获得具有功能性质效果更好的乳清蛋白肽，因此，在乳清蛋白肽功能特性的开发和利用，以及其对行为学的影响上，还需要进一步的研究。

[1]朴姗善,王昕,侯聚敏.乳清蛋白酶解物抗氧化能力的研究[J].农产品加工（创新版）,2011，5：59-64.

[2]FERR EIRA I,PINHO O,MOTAOTA M V,et al.Preparation of ingredients containing an ACE-inhibitory peptide by tryptic hydrolysis of whey protein concentrates[J].International Dairy Journal,2007,17（5）：481-487.

[3]DEMERS-MATHIEU V,GAUTHIER S F,BRITTEN M,et al.Antibacterial activity of peptides extracted from tryptic hydrolyzate of whey protein by nanofiltration[J].International Dairy Journal,2012.

[4]PENA-RAMOS E A，XIONG Y L.Antioxidative activity of whey protein hydrolysates in a liposomal system[J].J.Dairy Sci,2001,84（12）：2577-2583.

[5]TUGBA BAYRAM,MURAT PEKMEZ,NAZH ARDA.Antioxidant activity of whey protein fractions isolated by exclusion chromatography and protease treatment[J].Talanta 2008,75：705-709.

[6]包怡红,李雪龙,徐思源.乳清蛋白肽的制备及轻自由基的清除作用[J].中国乳品工业,2006,34（8）：23-26.

[7]HER NAN DEZ-LEDE SMA,B,DAVA LOS,A,BAR TO LO ME,B,et alAmigo,L.Proparation of antioxidant enzymatic hydrolysates fromα-lactalbumin andβ-lactoglobulin.Identification of active peptides by HPLC-MS/MS[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53：588-593.

[8]卞辑,于国萍,孙安敏，等.DA201-C大孔树脂对碱性蛋白酶制备的乳清蛋白肽脱盐效果的研究[J].食品工业,2014,15（2）：150-153.

[9]赵海峰,李学敏,肖荣.核桃提取物对改善小鼠学习和记忆作用的实验研究[J].山西医科大学学报,2004,35（1）：20-22.

[10]SURESH R,RAMESH RAO T.Effect of diagnostic ultrasound during the fetal period on learning and memory in mice[J].Ann Anat,2008,190（1）：37-45.

[11]ZHAO H,LI Q.Long-term ginsenoside consumption prevents memoru loss in aged SAMP8 mice by decreasing oxidative stress and up-regulating the plasticity-related proteinsin hippocampus[J].Brain Res,2009,1256,111-122.

[12]胡镜清,温泽淮,赖世隆.Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探[J].广州中医药大学学报,2000,17（2）：20-22.

[13]CV Vorhees.Exposure to 3,4-methylenedioxmetham-phetamine（MDMA）on postnatal days 11-20 induces refrence but not working memory deficits in the Morris water maze in rats：implications of prior learning[J].Int J Devl Neuro science,2004,22：247-259.