高灵敏间接竞争ELISA检测羊乳样本中的牛乳成分

王士峰，张世伟，赖心田，冯荣虎，伍聪，杨国武

（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518102）

0 引言

羊乳比牛乳更接近人乳而广受欢迎[1]，由于产量有限，市场价格较高。因暴利驱使，在羊乳中非法添加价廉牛乳等侵害消费者权益的事件时有发生。目前羊奶掺假牛奶主要检测方法包括电泳或等电聚焦[2-3]，色谱技术[4]，PCR 技术[5-6]，免疫学技术[7-11]及电子鼻技术[12]等。欧盟推荐检测方法为检测牛乳γ-酪蛋白（γ-casein，γ-CN）的等点聚焦技术，但操作繁琐，对人员素质要求较高。相比其他方法，免疫学检测技术（如ELISA）拥有简单灵敏，成本低的优点，主要检测牛乳中的蛋白成分，如β-酪蛋白（β-casein，β-CN）[7,11]，γ-CN[8]，IgG[9,10]等。牛羊乳蛋白构象相似，故针对牛乳蛋白多克隆抗体可能存在交叉反应；抗牛注入IgG的抗体特异性最高，但牛乳中IgG历经高温易变性，不适用于检测加热处理过的样本。danbairotein大，大师和本研究在前人的基础上，针对牛乳酪蛋白中含量最高的β-CN制备特异单克隆抗体，建立高灵敏可检测加热处理样本的ELISA方法，为国内羊乳掺伪的执法检测提供技术支持。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 抗原和实验动物

1.1.2 材料与试剂

标准品脱脂羊乳粉和脱脂牛乳粉，实验前用去离子水稀释为蛋白质量分数为3%的“复原乳”。生牛乳和生山羊乳分别采集于广东省深圳市和广州市本地农场，分装-20℃保存，使用前室温解冻，涡旋震荡后备用。标准品乳粉和生乳均经过SN/T 2051-2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法》检测，证明不含其他非本物种乳成分。另外本地超市和网购收集商品化羊乳粉，婴幼儿配方羊奶粉，灭菌全脂山羊乳，以及本地小区实地收集上门配送的纯山羊乳。α-CN、γ-CN、TMB、明胶、大豆球蛋白、乳白蛋白和牛血清白蛋白（BSA）购自sigma公司；HRP标记山羊抗小鼠二抗购自Proteintech公司。其他实验试剂均为国产分析纯，实验使用水均为去离子水。ELISA其他溶液配方见文献[13]。

1.1.3 仪器与设备

酶标仪，96孔酶标板和细胞培养瓶，洗板机，电热恒温振荡水槽，手持式酸度计等其他常规实验仪器。

1.2 方法

1.2.1 抗体制备

用尿素溶液配置β-CN母液，用PBS稀释为质量浓度200 μg/mL，和等体积免疫佐剂Quickantibody等体积混匀，小鼠大腿肌肉免疫100 μg/只，第21天等剂量加强免疫，第35天后尾部采血检测，测量血清多抗效价。单克隆抗体及腹水制备方法见文献[14]。

1.2.2 ELISA方法

使用本文中的5种焊接材料分别焊接无压W1基材与45钢母材，用微机控制万能材料试验机进行剪切试验，试验结果见表5。

用棋盘滴定法确定包被抗原、一抗、样品和酶标二抗稀释倍数。其他ELISA条件：96微孔板每孔用100 μL适当浓度β-CN包被，4℃孵育过夜，次日弃上清，用200 μL含有质量分数2%BSA的PBST溶液37℃封闭2 h，弃上清用PBST洗涤5遍拍干后，微孔板可密封4℃保存或立即使用。

间接竞争ELISA：取封闭好的微孔板室温平衡30 min，先加入50 μL标液或检测样本稀释液，再加入50 μL适合浓度单抗稀释液，37℃反应30 min，弃上清洗涤拍干后，加入HRP标记山羊抗小鼠二抗100 μL，37℃反应30 min，洗涤拍干后，加入TMB显色液，避光37℃反应10 min后，加入50 μL终止液终止反应，酶标仪450 nm检测吸光度值。

1.2.3 间接竞争ELISA标准曲线

本研究中选用的标准品脱脂牛乳粉蛋白质量分数为33.5%左右，先用去离子水制备蛋白质量分数3%的复原牛奶，先用PBST倍比稀释，按照优化好的ELISA条件进行竞争实验，每个浓度4个重复，建立logit-log回归标准曲线。

1.2.4 热稳定性与交叉反应

将生牛奶62℃水浴加热30 min，即得到巴氏杀菌乳；生牛乳121℃高压蒸汽灭菌20 min，即为高温灭菌乳。将生牛奶、巴氏杀菌乳、高温灭菌乳和复原牛乳用PBST倍比稀释，绘制竞争曲线。间接竞争ELISA检测不同蛋白样本的交叉反应率。交叉反应率=牛奶蛋白IC50/其他蛋白IC50×100%。

1.2.5 回收率与精密度

用复原牛乳和复原羊乳配置含20%，10%，5%，1%牛乳的羊乳样本，每质量分数4个重复，检测羊奶中牛奶比例，计算添加回收率：回收率=测量值/添加值×100%。同理计算相对标准偏差。

1.2.6 实际样本检测

称取等量标准品脱脂牛乳粉和待检乳粉样本，先用等量水稀释标准品和样本配置复原乳，再用PBST适当稀释，检测标准品和样本中的牛奶蛋白质量分数；液态鲜羊乳样本可直接用PBST稀释检测牛奶蛋白质量分数。样品中牛奶比例=蛋白质量分数（样本）/蛋白质量分数（标准品）×100%。

2 结果与分析

2.1 ELISA条件优化

图1 包被抗原及一抗稀释倍数优化

棋盘法确定包被抗原，一抗稀释倍数，结果如图1所示。选用OD450接近1.0为最佳浓度，最终确定β-CN包被质量浓度为1 μg/mL，多抗的稀释倍数为1∶8 000，筛选到的杂交瘤细胞株命名为3B9。用类似方法确定3B9单抗稀释倍数为1∶100 000。

图2 竞争抗原及酶标二抗稀释倍数优化

确定鲜乳及复原乳稀释倍数为100倍，二抗稀释倍数为1∶2000，结果如图2所示。由于鲜乳及乳制品成分复杂，推荐先将鲜乳（鲜乳蛋白含量3%左右）用PBST稀释100倍后进行实验；关于乳粉制品，先配置成蛋白质量分数3%左右的复原乳，稀释100倍后进行实验，此举有助于统一样品间的缓冲环境，提高ELISA系统稳定性。

2.2 多抗和单抗B39特异性比较

采用上述ELISA条件，使用血清多抗和3B9分别与复原牛奶和复原羊奶进行交叉反应，结果如图3和图4所示。由图3和图4可以看出，单抗3B9特异性明显优于血清多抗，但在样品浓度高的情况下，单抗与羊奶之间存在轻微交叉反应，可能是由于蛋白浓度过高抑制了系统反应，随着稀释倍数增加，交叉反应逐渐消失，说明3B9适用于建立ELISA方法。

2.3 热稳定性与交叉反应

用建立的ELISA方法检测生牛奶、巴氏灭菌乳、高温灭菌乳，选用标准品复原牛乳做对照，结果如图5所示。由图5可以看出，FDS乳生牛奶、巴氏灭菌乳、高温灭菌乳和标准批内务生牛奶、巴氏杀菌乳和高温灭菌乳的竞争抑制曲线并无明显不同，表明即使高达121℃高温并未对抗体识别表位造成影响。所以该方法适用于检测高温处理的液态乳和乳粉制品。

图3 血清多抗和牛羊乳间接竞争曲线

图4 单抗3B9和牛羊乳间接竞争曲线

图5 不同热处理乳的竞争曲线

B39抗体的交叉反应结果如表1所示。表1中，B39与各种牛酪蛋白均存在交叉反应，故本研究中选用牛奶总蛋白做标准竞争抗原；另外，抗体与羊奶总蛋白，大豆奶，BSA等常用蛋白样品无交叉反应，故特异性满足一般检测需要。

表1 mAb3B9交叉反应率

2.4 间接竞争ELISA标准曲线

令横坐标x=lg（蛋白浓度），y=In（B/B0），得到抑制回归曲线y=-0.92988-0.90047x，相关系数r2=0.9 966，线性检测范围为2.68 ng ～ 3.21 μg/mL，半数抑制质量浓度IC50值为92.8 ng/mL，最低检测限0.35 ng/mL。其中，B0为PBST空白对照OD450，B为不同实验组OD450。

2.5 回收率与精密度检测

采用ELISA检测不同比例掺杂样本，结果如表2所示。由表2可以看出，样本平均回收率在121%，平均相对标准偏差为9.7，最大值不超过12%，表明该方法重复性好，但回收率偏大，浓度越低时偏差越大。由于样本要经过上百倍稀释，极易引起结果偏差，但是对一般检测半定量检测需要已经足够。

表2 牛奶添加回收率

2.6 实际羊乳粉样本

分别采用ELISA方法和SN/T 2051-2008实时PCR法检测收集的配方羊奶粉和液态山羊奶样本。如表3所示，荧光PCR共检测到8个样本有牛基因成分，但是ELISA分析只有7个。结果显示由于标准缺失，市面上羊乳粉掺杂牛乳的情况确有发生，需要执法部门加强监管；此外荧光PCR显示出极高的灵敏性，但无法得出定量参考结果，而ELISA阳性结果中，2个样品添加低于5%，此程度掺杂利润已经不大，究其原因可能是生产加工过程中无意污染，相比那些大比例掺假，低于5%的阳性样本理应区别对待。

表3 实际羊奶样本检测

3 结论

本研究制备特异识别牛酪蛋白的单克隆抗体3B9，建立了可半定量检测羊乳样本中牛乳成分的间接竞争ELISA，理论最低检测限为3.24 ng/mL，显示出较高的灵敏度，且重复性好。该方法比基于多抗的ELISA拥有更高的灵敏度，且样品热处理不会对检测结果有明显影响。虽然该方法的灵敏度不及荧光PCR，但是操作时间短，步骤简单，技术要求低，适用执法大规模高通量筛查，此外可半定量检测样品中的牛奶蛋白成分，可排除微量无意污染样本，提高执法公正性。

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