鸭肝炎病毒对雏鸭脑组织损伤的研究

刘承军，夏新萌，王海丽

（1.聊城市动物医院，山东聊城 252000；2.聊城市畜牧兽医局，山东聊城 252000 3.聊城职业技术学院，山东聊城 252000）

鸭肝炎病毒对雏鸭脑组织损伤的研究

刘承军1，夏新萌2，王海丽3

（1.聊城市动物医院，山东聊城 252000；2.聊城市畜牧兽医局，山东聊城 252000 3.聊城职业技术学院，山东聊城 252000）

为系统研究鸭肝炎病毒（DHV）在脑组织引起的病理变化随时间的发展变化规律，通过人工感染雏鸭DHV的方法建立DHV的疾病病理模型，运用常规病理技术、组织中自由基的测定等方法，探索DHV感染时间的发展，脑组织病变和感染时间之间的关联度以及组织生化指标和脑组织病变之间的关联度。结果显示，试验组雏鸭大脑于攻毒后不同时间内出现不同程度的病理变化，脑组织中NO、MDA含量随时间变化一致。试验得出：NO在雏鸭病毒性肝炎的发生、发展的过程中发挥了重要作用，可能是雏鸭出现神经症状和脑组织病变的重要原因之一。

鸭肝炎；脑组织病变；一氧化氮；脂质过氧化反应；丙二醛

鸭病毒性肝炎是由I型鸭肝炎病毒引起的雏鸭的一种急性传染病，该病发病急、传播快、死亡率高[1]。1980年至今，鸭肝炎病毒在我国多次爆发，且发病严重，流行区域广，给养鸭业带来巨大的经济损失。本文针对人工感染雏鸭出现的明显神经症状，对神经系统进行病理组织学研究和分子生物学的研究，采用人工复制鸭肝炎病毒模型，动态取材脑组织，普通组织固定和HE染色，脑组织中NO和MDA含量的测定等方法，分析临床症状、组织学病变与组织NO、MDA含量之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

752紫外可见光分光光度计（SP-752PC上海精密科学仪器有限公司）；NO试剂盒、MDA试剂盒（购自南京建成生物科技有限公司）；离心机、切片机（上海化工机械）。

1.2 毒株

接种材料I型鸭肝炎病毒（DHV-1）由华中农业大学病理实验室保存。毒株复壮过程为：接种敏感、抗体阴性的健康樱桃谷鸭5只，每只腿部肌肉注射0.2mL，收集死亡鸭的肝脏进行匀浆，5倍生理盐水稀释，加双抗（青霉素、链霉素），过滤后-20℃保存备用。

1.3 实验动物

50羽1日龄鸭肝炎抗体阴性的健康樱桃谷鸭，购自武汉市天绿农业科技有限公司，常规饲养正大牌肉鸭料，自由饮水采食。4日龄后随机分为2组，每组25羽，一组为对照组，另外一组为试验组。在试验过程中死亡的鸭子，及时取其脑组织，进行HE染色。

1.4 方法

1.4.1 人工感染模式的复制及取材。试验组雏鸭进行腿部肌肉注射DHV-I病毒悬液0.2mL/羽，对照组25只，相同部位注射等量生理盐水。于隔离器内饲养。观察其临床症状，并与感染后0、3、6、12、24、48h按照3羽每组进行静脉放血处死，剖检观察病变，采集脑组织，1份甲醛固定用于制作石蜡切片、常规的HE染色；另一份研磨制成10%脑匀浆，用于NO和MDA浓度等的测定。

1.4.2 脑匀浆的制备。滤纸吸干脑组织表面的血液，准确称取1g脑组织块，用冷生理盐水冲洗，加入10mL冰冻磷酸盐缓冲液（pH7.2），制成100g/L组织匀浆，3000r/min离心15min，取上清液，-20℃保存待用。

1.4.3 测定方法。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法；NO利用硝酸还原酶特异性将硝酸根还原为亚硝酸根，通过显色深浅测定其浓度。

1.4.4 数据处理。数据结果均以平均数表示，用t检验法分析对照组和试验组间的差异显著性。

1.4.5 严格按有关程序对组织块脱水及HE染色。

2 结果及分析

2.1 临床变化

临床观察发现，对照组鸭没有发生特征性表现，在攻毒24h后，试验组雏鸭表现呆滞，离群独立，行动迟缓，精神沉郁，垂翅缩颈，部分鸭出现抽搐和运动失调等症状[2]；48h时部分雏鸭死亡，并与攻毒后72h全部死亡，死鸭呈典型角弓反张状态。剖检发现，肝脏肿大、质脆、色暗或发黄，表面有大小不等的斑点状出血[3]；雏鸭的大脑、肾脏、脾以及胰腺的表面有点状或块状出血，肠粘膜也肿胀、充血。

2.2 组织病理学变化

大脑于攻毒后3h出现轻度水肿（图1），3h到12h个别出现神经元死亡和血管淋巴细胞浸润（图2、图4）。24h神经细胞和血管周围出现明显的水肿，血管充血并见轻度出血（图3），48h后及死亡鸭只的脑组织[4]，胶质细胞呈局灶型增生，神经元形成坏死结节（图5），血管周围淋巴细胞浸润（图6），出现典型的神经元坏死病灶（图7）。

对照组神经组织如大脑、小脑等基本正常，偶尔见有轻度充血和水肿。

图1 感染3h后，感染雏鸭大脑，血管水肿

图2 感染3h后，感染雏鸭大脑，神经元坏死

图3 感染24h后，感染雏鸭大脑，脑膜下充血

图4 感染12h，感染雏鸭大脑，神经元坏死

图5 死亡雏鸭脑组织，神经元坏死后的小胶质细胞结节

2.3 NO、MDA测定结果

图6 死亡雏鸭脑组织，血管周围淋巴细胞浸润

图7 感染80h后，雏鸭脑组织，典型的坏死灶

表1 脑组织中NO、MDA含量的测定结果（n=3）

试验组雏鸭脑组织中NO含量测定结果见表1。脑组织中NO含量在接种后12h开始逐步升高，48h到达测定最大值，随后雏鸭开始死亡。脑组织中MDA含量从12h开始逐步增高，到48h达到测定最大值，和脑组织中NO含量变化一致。对照组脑组织中NO和MDA含量均变化不显著。这两项数据的一致性可以一定程度反映出，随着NO含量的增加，脑组织过氧化反应也在加剧，脑组织损伤不断推进。

2.4 小结

试验组雏鸭临床症状和剖检病变和组织学病

理变化相一致，可一定程度反映脑组织病变和雏鸭神经症状之间的关联程度。经过脑组织中NO和MAD的测定显示，NO含量随时间的变化规律和MDA随时间的变化相一致，可以反映出NO在脑组织病变中发挥了一定作用。纵向来看，NO在雏鸭病毒性肝炎的发生、发展的过程中发挥了一定作用；NO可能是雏鸭出现神经症状和脑组织病变的原因之一。

3 讨论

自由基是机体正常生化过程的产物，参与生物体许多病理、生理过程[4]。正常情况下，自由基的产生与清除保持着动态平衡。任何增强氧化作用和（或）降低抗氧化能力的因素均可打破这一平衡，致氧自由基增加。试验结果表明，氧自由基可以介导脑组织的损伤，导致疾病的发生、发展。生物体内的自由基，与过氧化氢反应所产生的羟自由基可引发脂类过氧化，导致细胞损伤，使细胞膜破坏，通透性增加，蛋白质及DNA变形[4]。

胡薛英等研究表明结果表明，鸭肝炎病毒对雏鸭神经组织的损伤，早期以水肿为主，后期以变形、坏死增生为主，与本试验结果相同。

PUFA在ROS的作用下，可在不饱和双键上不断发生过氧化反应，MDA为脂质过氧化的最终产物之一，它可反应脂质过氧化的程度，间接反映自由基变化程度。本试验结果表明，脑组织中MDA含量随着时间的发展不断增加，且在48h时含量最高，脑组织中的MDA含量增加规律同鸭的临床症状和组织学病变的发展规律一致，一定程度上反映了组织损伤的发展规律，同时也验证了脑组织的损伤一定程度上是由自由基反应引起的。

NO是常见的炎症介质。研究表明，NO参与了各种原因引起的组织损伤，既有保护性作用，又有细胞毒性作用。NO生成过多，将通过机体内蛋白质、脂肪、核酸等生物分子的作用，损伤组织细胞，对机体产生毒性作用。本试验结果试验组脑组织中NO含量随着时间的增加而不断增加，表明NO在疾病发生发展过程中扮演了很重要的角色，在脑组织损伤方面发挥了一定的作用。NO做为一种重要的自由基，在脑组织生理、病理方面都扮演了很重要的角色；MDA作为自由基脂质过氧化反应的一种重要产物，其测定从反应细胞膜损伤方面具有一定意义[5]。但是NO和MDA之间具体的量化关系尚不明确，NO引起脑组织细胞其他方面的病变（比如增生、核酸、蛋白质损伤）尚不明确，需要我们进一步研究。

[1]王丙云，黄兴国，陈志胜，等．雏鸭感染鸭病毒性肝炎后神经系统的动态病理学观察[J]．中国兽医杂志，2003（1）：14-15.

[2]赵海全，王丙云，冯军，等．鸭肝炎病毒对雏鸭肝组织中MDA和GSH-PX的影响[J]．中国家禽，2003（11）：11-12.

[3]蒋学军，夏邦才，林松女．雏鸭病毒性肝炎综合防治[J].中国畜牧兽医，2007（5）：1.

[4]郑艳华，胡薛英，程国富，等．感染新型鸭肝炎病毒雏鸭的SOD活性和MDA含量变化[J]. 中国兽医科技，2004（12），6-9．

[5]丛涛，赵霖，鲍善芬．临床营养学研究中脂质过氧化的评价方法[J]．中国临床营养杂志，2004（2）：127-131.

A Study on the Damages Caused by Duck Hepatitis Virus（DHV）in the Duckling Brain Tissues

Liu Chengjun1，Xia Xinmeng2，Wang Haili3
（1.Liaocheng Animal Hospital，Liaocheng，Shandong 252000；2. Liaocheng Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Liaocheng，Shandong，252000；3.Liaocheng Vocational＆Technical College，Liaocheng，Shandong 252000）

In order to study the pathological changes in brain tissues caused by DHV with time，the pathology model was established by means of artificial infection of ducklings with DHV. Conventional pathology techniques and the tissue free radical determination were used to detect the DHV infection development，the association of brain lesions with infection time and the association of biochemical index with pathological lesions. Results showed that the test duckling group developed pathological changes in the brain in different degrees at different times，NO and MDA in the brain tissue changed consistently with time. It was concluded that NO played an important role in the incidence of viral hepatitis ducklings and the process of development，which may be one of the important reasons of neurological symptoms and brain lesions in ducklings.

DVH； brain tissue；NO；lipid peroxidation；malondialdehyde.

S852.657；S858.32

B

1005-944X（2015）06-0060-04