2型糖尿病女性人群AMPKα2基因多态性与冠心病及脂联素 抵抗素的关系

叶荣苹 李晟 施翔翔 刘伟 肖建新

2型糖尿病女性人群AMPKα2基因多态性与冠心病及脂联素 抵抗素的关系

叶荣苹 李晟 施翔翔 刘伟 肖建新

目的 探讨2型糖尿病（T2DM）女性患者AMPKα2基因多态性（rs2796516）与冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）的相关性，及与脂联素、抵抗素的关系。方法 收集40例CAD合并T2DM女性患者（CAD+DM组）和45例T2DM女性患者（DM组），利用聚合酶链限制性长度多态性分析（PCR-RFLP）及基因测序技术检测AMPKα2基因多态性。并通过酶联免疫法（ELISA）测定血清脂联素、抵抗素浓度。结果 两组间AMPKα2基因型分布差异有统计学意义（χ2=6.50，P=0.04），GG基因型为CAD+DM发病的保护因素（OR为0.33，95% C.I.为0.13～0.81; χ2=5.95；P=0.02），AMPKα2基因多态性与脂联素、抵抗素及低密度脂蛋白水平明显相关。结论 T2DM女性患者AMPKα2基因多态性（rs2796516）与CAD及脂联素、抵抗素水平具有相关性。

腺苷酸活化蛋白激酶 基因多态性 冠心病 脂联素 抵抗素

糖尿病及动脉粥样硬化是当前严重影响人类健康的全球性公共卫生问题。88%的糖尿病和代谢综合征患者其超声心动图显示颈动脉有动脉粥样硬化征象。脂联素、抵抗素是近年来发现的新型脂肪细胞分泌的肽类激素［1］，国内研究［2］证实AMPKα2 基因（rs2796516）与脂联素存在关联性，因此，AMPKα2基因多态性可能与冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）风险相关。本文探讨T2DM女性患者rs2796516基因多态性与CAD及脂联素、抵抗素水平的相关性。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2013年1月至2014年5月因胸痛在中国解放军第118医院、温州医科大学附属第一医院心内科住院的T2DM女性患者85例，并根据冠状动脉造影检查（CAG）或64层螺旋CT冠状动脉成像，确定冠状动脉狭窄。分为冠心病合并糖尿病组（CAD+DM组）40例，经CAG证实存在至少一支冠状动脉狭窄≥50%，年龄49～88岁，平均（55.3±16.12）岁。单纯糖尿病组（DM组）45例，经CAG或64层螺旋CT冠状动脉成像证实无冠状动脉狭窄或狭窄程度＜50%，年龄43～81岁，平均（51.64±14.37）岁。排除标准：（1）吸烟患者。（2）急、慢性感染者。（3）近期有创伤、手术或血管重建患者。（4）甲状腺功能异常。（5）全身免疫性疾病。（6）3个月内曾出现心肌梗死、中风或短暂性脑缺血（TIA）发作。（7）纽约心脏病协会（NYHA）心力衰竭分级Ⅲ级或Ⅳ级。（8）肝脏疾病。（9）严重肾功能不全。（10）恶性肿瘤患者。两组对象均为无血缘关系的散发人群，本项目得到各医院伦理委员会批准，所有对象均签署知情同意书。

1.2 临床资料获取 问卷内容包括一般情况、健康相关行为、饮酒、吸烟、饮食习惯、运动情况、疾病史、并进行体格检查、包括身高、体重、血压等。入院次日清晨空腹行血生化、FPG、血脂、糖化血红蛋白等检查。采用酶联免疫分析法（ELISA）测定血清脂联素和抵抗素水平，操作方法严格按试剂盒说明书（上海华舜生物工程有限公司）进行。

1.3 AMPKα2基因型检测 所有受检者均晨空腹抽取外周静脉血2ml，采用DNA试剂盒提取人类白细胞基因组DNA。将提取好的DNA置于-20℃冰箱保存备用。基因引物参考文献［3］上游引物: 5’-CAT AGA TTA GCA GCA TTG AAA GC-3’，下游引物: 5’-AATACA CCC ACC AGA ATA GCA CA-3’。行直接测序方法，读取个体的基因型。见图1、2、3。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0软件分析等位基因和基因型频率与CAD的关联性。经Hardy-Weinberg平衡检验确认样本的群体代表性，基因型及等位基因频率的比较行χ2检验，计量资料以（x±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 SNP rs2796516测序AA基因型

图2 SNP rs2796516测序AG基因型

图3 SNP rs2796516测序GG基因型

2 结果

2.1 CAD+DM组与DM组各观察指标比较 两组年龄、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、TG、TC、FPG、HDL-C、糖化血红蛋白差异无统计学意义（P＞0.05）。CAD+DM组BMI、LDL-C、抵抗素均高于DM组，差异有统计学意义（P＜0.05），而脂联素较DM组低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 CAD+DM组与DM组各观察指标比较（x±s）

2.2 CAD+DM组与DM组AMPKα2基因多态性比较 基因型频率在两组间AMPKα2基因型分布差异有统计学意义（χ2=6.50，P=0.04）；CAD+DM组和DM组G型等位基因频率分别为64%和83%，两组间等位基因分布差异有统计学意义（χ2=8.04，P=0.01）。GG基因型为CAD+DM发病的保护因素（OR为0.33，95% C.I.为0.13～0.81; χ2=5.95；P=0.02）见表2。

表2 CAD+DM组与DM组AMPK2基因多态性基因型分布和等位基因频率分布

2.3 Hardy-Weinberg 平衡分析 CAD+DM组χ2=3.52；P=0.06，DM组χ2=3.53；P=0.06，可以认为两组趋向于遗传平衡。见表3。

表3 CAD+DM组与DM组AMPKα2基因多态性基因型Hardy-Weinberg 平衡检验

2.4 不同AMPKα2基因型的血清脂联素及抵抗素水平比较 脂联素水平比较，GG基因型脂联素水平较GA及AA基因型高，GA基因型脂联素水平较AA基因型高，差异有统计学意义（P＜0.05）。抵抗素水平比较，GG基因型抵抗素水平较GA及AA基因型低，差异有统计学意义（P＜0.05）。LDL-C水平比较，GG及GA基因型LDL-C水平均较AA基因型低，差异有统计学意义（P＜0.05），余指标各基因型组间比较无统计学意义。见表4。

表4 不同AMPKα2基因型的血清脂联素、抵抗素水平比较（x±s）

3 讨论

本资料通过控制两组间多个危险因素及观察指标，如高血压，血糖差异。CAD+DM组BMI、LDL-C、抵抗素均明显高于DM组（P＜0.05），而脂联素较DM组明显降低。其次，通过两组AMPKα2基因多态性（rs2796516）等位基因频率比较结果发现，G型等位基因频率分别为64%和83%，频率明显低于DM组（P＜0.05），表明该位点G型等位基因可能减少冠心病发病风险，OR=0.39而CHD+DM和DM组基因型比较，GG基因型分别为48%和73%，频率明显低于DM组（P＜0.05），且GG基因型OR=0.33，提示该基因型可减少冠心病发病风险，由此可得出结论，AMPKα2基因多态性（rs2796516）与冠心病感性有一定的相关性。

已有资料报道［2］，甘肃地区汉族人群AMPKα2基因多态性（rs2796516）与T2DM及血清脂联素、抵抗素水平有明显相关性。Spencer-Jones等［3］通过对2777例高加索地区健康女性进行了PRKAA2基因筛选（rs1124900，rs2796516，rs2746342，rs2796498，rsl41844），显示rs2796516与甘油三酯，ApoB及中心性肥胖显著相关。本资料结果与上述研究结果类似，本资料所有对象均为浙南地区T2DM女性人群，并控制血压，吸烟等血管危险因素，所有研究对象不同基因型之间脂联素、抵抗素及LDL-C水平比较，结果显示，GG等位基因的脂联素水平高于GA及AA基因型，而抵抗素及LCL-C水平显著低于GA及AA基因型，考虑为rs2796516位点A型等位基因可以通过增加胰岛素抵抗的趋势［4］，并使胰岛β细胞分泌功能下降，从而影响AMPK通路，导致血脂代谢异常，使脂联素水平降低，抵抗素及LCL-C水平上升，从而加速动脉粥样硬化过程［5］。本研究推测AMPKα2基因多态性（rs2796516）可能机制为AA基因型转录活性较GA及GG型低。在缺血缺氧及再灌注等条件下，尤以心肌细胞及脑组织细胞的能量消耗以及氧消耗最大，AMPKα2基因多态性（rs2796516）A等位基因的突变可能导致AMPK对下游蛋白激酶的磷酸化的调控减低［6］，血管内皮细胞及周围组织细胞因ATP减少引起内环境的改变，并使原有的抑制能量消耗负反馈途径激活不全。从而导致血管（冠状动脉）内皮细胞的凋亡及动脉粥样硬化进展。

本研究通过比较CAD合并T2DM患者与2型糖尿病人群的AMPKα2基因多态性（rs2796516）比较，结果提示浙南地区2型糖尿病人群中AMPKα2基因多态性（rs2796516）与冠心病发生存在一定的相关性，本研究样本量仍偏小，结果仍有待扩大样本量来证实。

1 Kawanami D, Maemura K, Takeda N,et al. Direct reciprocal effects of resistin and adiponectin on vascular endothelial cells: a new insight into adipocytokine-endothelial cell interactions. Biochem Biophys Res Commun. 2004,314(2):415～419.

2 刘婧星,任建功,孙保生,等. AMPKα2基因多态性与2型糖尿病及脂联素、抵抗素的关系.基础医学与临床,2011,3(12)1366～1370

3 Speneer-Jones NJ,Ge D,Snieder H,et al. AMP-kinase alpha 2 subunit gene PRKAA2 variants are associated with totaled cholesterol,lowdensity lipoprotein-cholesterol and high-density lipoproteincholesterol in normal women. J Med Genet,2006,43(12):936～942.

4 Kuang X,Yan M,Ajmo JM,et al. Activation of AMP-activated protein kinase in cerebella of Atm-mice is attributable to accumulation of reactive oxygen species.Biochem Biophys Res Commun,2012,418(2):267～272.

5 Wallace BK,Foroutan S,O'Donnell ME. Ischemia-induced stimulation of Na-K-Cl cotransport in cerebral microvascular endothelial cells involves AMP kinase.Am J Physiol Cell Physiol,2011,301(2):316～326.

6 Venna VR,Li J,Benashski SE,et al. Preconditioning induces sustained neuroprotection by downregulation of adenosine 5-monophosphateactivated protein kinase . Neuroscience,2012,201:280～287.

Objective The aim of this study was to investigate the possible role of AMPKα2 gene（rs11549467）variant in the development of coronary artery disease in women with type 2 diabetics（T2DM），adiponectin and resistin. Methods We analyzed 40 coronary artery disease in women with T2DM patients and 45 T2DM controls using polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）and sequence-based typing developed in our laboratory. ELISA technique was employed to determine the plasma adiponectin and resistin concentration. Results The AMPKα2 gene（rs11549467）variant was found to be signifi cantly associated with coronary artery disease（χ2=6.50 P=0.04）The individuals with the GG genotype showed statistically signifi cant increased risk for coronary artery disease（OR=0.33，95% C.I.=0.13-0.81; χ2=5.95；P=0.02）. AMPKα2 variant was significantly related to blood lipid and the concentration of plasma adiponectin and resistin.Conclusion The AMPKα2 gene（rs11549467）variant may be a genetic risk factor for developing coronary artery disease in women with T2DM. Whereas the AMPKα2 gene（rs11549467）variant was revelant with T2DM，the concentration of plasma adiponectin and resistin.

AMP-activated protein kinase（AMPK） Gene polymorphism Coronary artery disease Resistin Adiponectin

浙江省温州市科技计划项目（Y20130363）

325000 解放军第118医院心血管内科（叶荣苹 李晟 刘伟 肖建新）

325000 温州医科大学附属第一医院心血管内科（施翔翔）