响应面分析法优化马兰总黄酮提取工艺研究

响应面分析法优化马兰总黄酮提取工艺研究

王诤，王国凯，刘劲松，蔡百祥，高卫娜，王刚

(安徽中医药大学药学院现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥230012)

[摘要]目的应用响应面分析法优化马兰总黄酮的提取工艺。方法以单因素研究为基础，以总黄酮提取量为响应值，以4因素3水平的响应面分析法优化马兰总黄酮的提取工艺。结果马兰总黄酮的最优提取工艺条件为：乙醇浓度为40%，液料比为16.5∶1，提取时间为2 h，提取次数3次，在该条件下，马兰总黄酮提取量预测值为162.538 mg，实际验证值为156.867 mg，并得出各因素对马兰总黄酮提取量的影响大小依次为乙醇浓度、液料比、提取次数、提取时间。结论响应面分析法可用于优化马兰总黄酮的提取工艺，实验验证值与模型预测值基本相符。

[关键词]马兰；总黄酮；提取工艺；响应面分析法

[中图分类号]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.026

基金项目：国家自然科学

作者简介：王诤(1991-)，男，硕士研究生

收稿日期：(2015-01-27；编辑：姚实林)

马兰，别名鱼鳅串、田边菊，菊科，多年生草本。马兰载于《本草拾遗》，全草药用，有清热解毒、消食积、利小便、散瘀止血之效[1]。全国各地均有分布，具有极其丰富的野生资源。民间常作为保肝明目的保健食品大量食用[2]。

近年来对马兰总黄酮的研究较多，优化总黄酮最佳提取工艺不仅能更有效地利用资源，也为进一步深入研究马兰提供依据。响应面分析法能够以最小的成本对多变量系统进行极其有效的优化，并能准确分析各因素对响应值的影响以及各因素间的交互作用对响应值的影响。通过传统正交方法只能得出最佳的因素水平组合，不能得出整体区域中各因素的最优组合和最优响应值，而响应面设计方法通过更多的水平实验方案，拟合二阶以上的模型，以找到设计的最优点[3-4]。

通信作者：王国凯，wanggk7779@163.com

本研究以马兰总黄酮提取含量为响应值，应用响应面分析法优化马兰总黄酮的提取条件，从而得出最优的马兰总黄酮提取工艺，以期为今后的马兰相关研究提供参考。

1　仪器与材料

马兰：购自安徽省亳州市药材市场，经安徽中医药大学中药标本中心黄和平副教授鉴定为菊科植物马兰Kalimerisindica(L.) Sch-Bip的干燥全草；芦丁对照品：购自中国药品生物制品检定研究院；实验过程中所用化学试剂：纯度均为分析纯。UV759CRT紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；十万分之一电子天平：赛多利斯仪器系统有限公司。

Determination of Content of 6-Gingerol in Kean Cream by High-Performance Liquid Chromatography

ZHENGZhi-yun1,GUIShuang-ying1,LONGZi-jiang1,ZHOUXu-tian2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiEngineeringResearchCenterforChineseMedicinePreparation&InstituteofPharmaceutics,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnqingAnticancer&AnalgesiaResearchInstitute,AnhuiAnqing246001,China)

Abstract[] ObjectiveTo establish a method for determination of the content of 6-gingerol in Kean Cream by high-performance liquid chromatography (HPLC). MethodsThe C18 chromatographic column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used with a mobile phase of methanol-water (70∶30). The detection wavelength was 280 nm; the flow rate was 1.0 mL/min; the column temperature was 30 ℃; the sample size was 20 μL. ResultsA good linear relationship was achieved when the concentration of 6-gingerol ranged between 1.02 and 20.4 μg/mL (r=0.999 9). The average recovery rate was 98.83%, and the relative standard deviation was 1.08% (n=6).ConclusionThe HPLC-based method is simple, precise, and reliable for determination of content of 6-gingerol in Kean Cream.

[Key words]high-performance liquid chromatography; 6-Gingerol; Kean Cream; content determination

2　方法与结果

2.1线性关系考察准确称取干燥后的芦丁对照品8.6 mg，以浓度为75%的乙醇于25 mL容量瓶中定容至刻度，充分溶解后摇匀，得对照品溶液(0.344 mg/mL)。分别量取0.25、0.5、0.75、1.00、1.25 mL置于5个5 mL容量瓶中，再分别加入0.2 mL浓度为5%的NaNO2溶液，摇匀，静置5 min后，再加入0.2 mL浓度为10%的Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min后，加入2 mL浓度为4%的NaOH溶液，然后，以75%的乙醇定容，摇匀后静置15 min，以样品空白溶剂为参比液，在波长506 nm处测得其吸光度[5-6]。绘制以所测得的吸光度值为纵坐标，以稀释后对照品溶液的浓度为横坐标的标准曲线，得到以浓度为自变量、吸光度为因变量的标准曲线回归方程：y=0.112 5x+0.008 1，r=0.999 5。结果显示，对照品溶液浓度在8.72～52.32 μg/mL时与吸光度有较好的线性关系。

2.2马兰总黄酮的提取工艺取干燥药材粉末50 g，用乙醇回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩，干燥，得干浸膏，取样定容，按“2.1”项下方法测得吸光度。

2.3单因素试验根据相关文献，通过控制变量的方法分别考察乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数4个因素对马兰中总黄酮提取量的影响，试验结果见图1。由结果可知，综合考虑，4个因素的最优值分别确定为：乙醇浓度为50%，液料比为15∶1，提取3次，每次提取1.5 h。

图1 乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)对马兰总黄酮提取含量(50 g马兰中提取量)的影响

参考文献2.4Box-Behnken试验设计以单因素试验及相关为依据来设定Box-Behnken实验设计中各因素的水平，以马兰总黄酮提取量为响应值，对影响马兰总黄酮提取量的乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)进行优化，响应面试验设计因子水平见表1。使用Design Expert 8.05b对数据进行处理及分析。

表1　响应面试验设计因子水平表

2.5响应面实验结果根据Box-Behnken试验设计原理及单因素试验所得结果，选择“2.4”项4个影响因素，并以单因素试验结果为中心水平，进行4因素3水平的响应面优化实验，确定最佳提取条件。实验结果见表2。

使用Design Expert 8.05b 统计软件对实验所得数据进行多元回归拟合，得到总黄酮提取量对A、B、C、D四因素的二次多项回归方程：总黄酮提取量=145.74-10.15A-8.43B-1.95C+ 4.41D-9.39AB-16.73AC+9.33AD-1.16BC+2.33BD+8.21CD-3.35A2-0.82B2-5.37C2-5.57D2。

对上述模型进行方差分析(见表3)发现，一次项中乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取次数(D)，二次项中提取时间(C2)、提取次数(D2)，交互项中乙醇浓度和提取时间(AC)、乙醇浓度和提取次数(AD)、提取时间和提取次数(CD)对总黄酮提取量的影响均具有统计学意义(P<0.05)，表明各因素对总黄酮提取量的影响不是简单的线性关系。回归方程的显著性检测结果具有统计学意义(P<0.000 1)，回归方程的失拟(lack of fit)检验结果不具有统计学意义(P=0.696 1)；回归方程的拟合优度很高(R2=0.948 5，校正R2=0.897，CV=3.11%)，说明上述方程能较好地反映A、B、C、D四个因素与马兰总黄酮提取量的关系。

图2显示，总黄酮提取量随着提取时间和提取次数的增加呈不断上升趋势，由其等高线图可看出，等高线在提取时间轴方向分布较为密集，说明提取时间对总黄酮提取量的影响较提取次数的影响大，另外，等高线呈现出较规则的椭圆形，说明C、D因素之间存在较为显著的交互效应[7]。由图3可知，黄酮含量随液料比和提取次数的增大而不断增大，由等高线图可知，液料比对总黄酮提取量的影响比提取次数大。同理，由图4、图5、图6、图7可得出，液料比对总黄酮提取量的影响大于提取时间的影响，乙醇浓度对总黄酮提取量的影响大于提取次数，乙醇浓度和提取时间二者对总黄酮提取量的交互作用很强，且乙醇浓度的影响大于提取时间，乙醇浓度与液料比之间也有较好的交互作用。因此，可以得出各因素对总黄酮提取量的影响程度依次为：A>B>D>C。

表2　响应面实验设计方案及结果

表3　回归模型方差分析

使用Design Expert 8.05b对回归方程进行求解，得出预测最优提取工艺为：乙醇浓度为40%，液料比为16.46∶1，提取时间2.00 h，提取次数为3.39，总黄酮含量的预测值为162.538 mg(50 g生药)。综合考虑将工艺调整为：乙醇浓度为40%，液料比为16.5∶1，提取2 h，提取3次。

按照上述所得工艺，平行提取3份，测定实际平均总黄酮提取量为156.86 mg(50 g生药)，与预测值之间偏差较小，表明此回归模型能与实际情况较好拟合，从而也更加证明此模型的可行性。

4　讨论

响应面分析法是一种更为合理有效的试验设计方法，它通过利用合理的试验设计方法并通过试验得到数据，采用多元二次回归方程来拟合因子和响应值之间的函数关系，指导多变量优化问题[8]。以最经济、简便的方式优化得出最优工艺，与正交试验设计法不同，它不仅能够克服正交设计无法从整体区域找出因素的最优组合和响应值的缺陷，还能够得出精度较高的回归方程，并且具有能够分析各因素间交互效应的优点。

本研究以单因素研究为基础，以响应面分析法对马兰总黄酮的提取工艺进行优化，得出了最优的工艺条件，并且验证实验结果与预测值相近，可见实验设计及结果分析都比较准确可靠，综上所述，响应面分析法是优化马兰总黄酮提取工艺的有效方法。

图2　提取时间和提取次数对马兰总黄酮提取量影响的效应面图和等高线图

图3　液料比和提取次数对马兰总黄酮提取量影响的效应面图和等高线图

图4　液料比和提取时间对马兰总黄酮提取量影响的效应面图和等高线图

图5　乙醇浓度和提取次数对马兰总黄酮提取量影响的效应面图和等高线图

图6　乙醇浓度和提取时间对马兰总黄酮提取量影响的效应面图和等高线图

图7乙醇浓度和液料比对马兰总黄酮提取量影响的效应面图和等高线图

参考文献:

[1]刘跃钧,姜根平,兰冬香,等.野生马兰研究开发现状概述[J].中药材,2011,34 (6):992-996.

[2]王镠园.马兰的综合研究分析[J].现代医药卫生,2013,29 (1):86-88.

[3]张灿,张海晖,武妍,等. 马兰黄酮类化合物的提取及其抗氧化活性[J].农业工程学报,2011,27(S2):307-311.

[4]林颖华,吴晓玲,彭荣珍,等.响应面法优化豆腐柴中总黄酮提取工艺[J].中国医药导报,2013,10(18):116-118.

[5]徐金龙,张红梅,徐秀泉.响应面分析法优化牡丹皮中总黄酮的提取工艺[J].中国药房,2011,22(27):2536-2538.

[6]周向军,高义霞,汪之波,等.响应面法优化西兰花总黄酮提取工艺的研究[J].资源开发与市场,2010,26(6): 488-489.

[7]郑和权,周守标,朱肖锋,等.马兰总黄酮提取工艺优化及不同部位含量测定[J].食品与发酵工业,2008,34(11): 185-189.

[8]王永菲,王成国.响应面法的理论与应用[J].中央民族大学学报:自然科学版,2005,14 (3):236-240.

Optimization of Extraction Technique for Total Flavonoids inKalimerisindica(L.) Sch-Bip by Response Surface Analysis

WANGZheng,WANGGuo-kai,LIUJin-song,CAIBai-xiang,GAOWei-na,WANGGang

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiKeyLaboratoryofModernChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China)

Abstract[] ObjectiveTo optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip by response surface analysis. MethodsBased on the single-factor experiment and with the yield of total flavonoids as the response, a four-factor, three-level response surface analysis was used to optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip. ResultsThe results indicated that in the optimal extraction technique, raw material was treated with 40% ethanol (16.5 times) three times (2 h each time). In this condition, the predicted and experimental yields of total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip were 162.538 mg and 156.867 mg, respectively. The most important influencing factor for the yield of total flavonoids was ethanol concentration, followed by solid-liquid ratio, extraction times, and extraction duration. ConclusionResponse surface analysis can be used to optimize the extraction technique for total flavonoids in Kalimeris indica (L.) Sch-Bip. The experimental value almost accords with the predicted value.

[Key words]Kalimerisindica(L.) Sch-Bip; total flavonoids; extraction technique; response surface analysis