N-乙酰半胱氨酸对低渗对比剂急性肾损伤模型大鼠肾组织的影响

王琳， 李文华， 陈静， 何海燕， 余亚仁

N-乙酰半胱氨酸对低渗对比剂急性肾损伤模型大鼠肾组织的影响

王琳， 李文华， 陈静， 何海燕， 余亚仁

目的：通过建立大鼠低渗对比剂急性肾损伤动物模型，观察N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预后肾损伤的变化，从而对临床治疗对比剂诱导的急性肾损伤提供理论依据。

方法：清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组（n=15）,对比剂肾损伤模型组（对比剂损伤组，n=15），N-乙酰半胱氨酸对照组 （n=15） 及N-乙酰半胱氨酸治疗组（治疗组，n=15）。分别于造模后第24 h、48 h、72 h处死动物,并检测血肌酐值, 病理切片及苏木素-伊红（HE）染色评估肾小管损伤程度，试剂盒检测肾组织氧化应激指标丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活性。

结果： ①与正常对照组和N-乙酰半胱氨酸对照组相比，对比剂损伤组在建模后第48 h、72 h血清肌酐值显著升高（P＜0.01），治疗组在相同时间点较对比剂损伤组血清肌酐值显著下降（P＜0.01）；②HE染色可见对比剂损伤组在建模后24 h至72 h均出现不同程度的急性肾小管损伤，伴或不伴上皮细胞刷状缘脱落、空泡变性、细胞脱落及再生，部分肾小管结构破坏；与正常对照组和N-乙酰半胱氨酸对照组比较，对比剂损伤组和治疗组肾小管损伤评分显著升高（P＜0.05），治疗组在相同时间点较对比剂损伤组肾小管损伤评分显著降低 （P＜0.05），差异均有统计学意义；③与正常对照组和N-乙酰半胱氨酸对照组比较，氧化应激标志物丙二醛含量、T-SOD活性在对比剂损伤组和治疗组变化显著（P＜0.01），治疗组与对比剂损伤组比较差异亦有统计学意义 （P＜0.05）。

结论：N-乙酰半胱氨酸可以减轻低渗对比剂诱导的急性肾小管上皮细胞的损伤。

对比剂肾病； N-乙酰半胱氨酸；血肌酐；肾小管损伤

Methods: A total of 60 male SD rats were randomly divided into 4 groups:①Control group, with normal rats,②Contrast-induced nephropathy (CIN) group,③NAC group, the rats received NAC pre-treatment followed by normal saline injection, ④Treatment group, the rats received NAC pre-treatment followed by contrast media injection. n=15 in each group. The animals were sacrifced at 24 h, 48 h and 72 h respectively after modeling. The renal function was evaluated by serum creatinine, tissue injury was examined by HE-staining and the renal oxidative stress condition was measured by MDA and T-SOD activities.

Results: ①Compared with Control group, CIN group showed obviously increased serum creatinine levels at 48 h, 72 h after the modeling, P＜0.01, while compared with CIN group, the creatinine levels were lower in Treatment group at the same time points, P＜0.01. ②HE-staining presented that CIN group had different levels of acute tubular injury, with or without brush border epithelial cell shedding, vacuolar degeneration, cell loss and regeneration and partially tubular structural damage at 24 h, 72 h after the modeling; compared with Control group and NAC group, the renal injury scores in CIN group and Treatment group were significantly increased, P＜0.05, while Treatment group had much less renal

injury than CIN group at the same time points, P＜0.05. ③Compared with Control group and NAC group, the MDA and T-SOD activities were obviously changed in CIN group and Treatment group, P＜0.01, the MDA and T-SOD activities were different between Treatment group and CIN group, P＜0.05.

Conclusion: NAC may reduce the injury of renal tubular epithelial cells in contrast-induced nephropathy in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:168.)

随着介入治疗水平的提高，对比剂使用引起的肾损伤逐渐增多。对比剂肾损伤已经成为了院内获得性急性肾功能衰竭的第三大原因，约占所有获得性急性肾损伤发病率的11%[1-2]。对比剂肾损伤的发生增加了院内死亡率（发生对比剂肾损伤后患者死亡率与未发生对比剂肾损伤患者死亡率分别为31%和6% ）、致残率、透析率，加速发生终末期肾病（ESRD）风险，延长住院时间和增加花费[3]。因此最好的治疗方法是预防。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是细胞内还原性谷胱苷肽的前体，具有干扰自由基生成、清除已生成的自由基、抗氧化作用，本研究观察N-乙酰半胱氨酸其能否对对比剂肾病有防治作用。

1 材料与方法

实验动物与试剂：2013-10至2014-04选择清洁级雄性SD大鼠60只，体重（200±20）g，由徐州医学院实验动物中心提供。试剂：吲哚美辛（美国Sigma公司）；左旋硝基精氨酸甲酯（L—NAME）（美国Sigma公司）；N-乙酰半胱氨酸（美国Sigma公司）；碘海醇注射液350 mgI/ml（扬子江药业有限公司）；总超氧化物岐化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

实验分组及对比剂肾损伤模型建立 ： SD大鼠60只,实验前一日将实验动物称重打耳孔标记后进行随机分组：正常对照组（n=15）, 对比剂肾损伤模型组（对比剂损伤组, n=15），N-乙酰半胱氨酸对照组 （n=15） 及N-乙酰半胱氨酸治疗组（治疗组，n=15）。对比剂损伤组大鼠禁食水 12 h后,尾静脉注射预先配置的吲哚美辛 10 mg/kg，15 min后尾静脉注射左旋硝基精氨酸甲酯10 mg/kg，15 min后尾静脉注射碘海醇 （3g I/kg）[4]。治疗组建模前12 h腹腔注射 N-乙酰半胱氨酸 10 mg/kg,再建对比剂肾损伤模型。N-乙酰半胱氨酸对照组建模前12 h腹腔注射 N-乙酰半胱氨酸10 mg/kg,之后予以等量的生理盐水尾静脉注射。正常对照组予以等量的生理盐水分别进行腹腔和尾静脉注射。每组分别于建模后第24 h、48 h、72 h处死动物各5只，处死前打开腹腔腔静脉采血3 ml，以3000 r/min，4℃离心20 min，取上清在OLYMPUS AU2700自动生化仪上检测血清肌酐（Scr）值。采血后在冰上取两侧肾脏，置于冰的磷酸盐缓冲液（PBS）中，快速去除肾包膜，一侧肾迅速置于10%中性福尔马林中固定。另一侧肾迅速用滤纸吸干水分，锡箔纸包好后置于-80℃冰箱中冰冻保存。

病理切片及苏木素-伊红（HE）染色评估肾小管损伤程度：取出的肾脏经10%中性福尔马林固定后24 h后，常规石蜡包埋切片后二甲苯脱蜡，梯度酒精进水，苏木素染色，盐酸酒精分化，碳酸锂兰化，伊红染色；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。在病理科医生指导下，光学显微镜下双盲观察，每张切片于400倍显微镜下随机取10个肾小管间质视野，进行肾小管损伤评分。评分标准：无损伤（- 或 0）， 轻度 （± 或 1， 单细胞的，片状孤立损伤），中度 （+ 或 2， 损伤≤25%）， 重度 （++ 或3，25%＜损伤≤50%）， 极重度 （+++ 或 4，损伤＞50%）[5]。每张切片10个视野评分总和的均值为肾小管损伤评分。

肾组织氧化应激指标丙二醛含量、T-SOD活性：称取肾皮质按1:9加入生理盐水冰上匀浆，在4℃以3000 r/min离心20 min 取上清用建成试剂盒测量。肾组织丙二醛含量通过其与硫代巴比妥酸缩合产生红色产物在532 nm处有最大吸收峰被检出[6]。SOD活性通过亚硝酸盐的减少率来计算。1 mg组织蛋白在1 ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）[7]，其紫红色产物在550 nm处有最大吸收峰。

统计学处理：采用SPSS 17.0统计分析软件。正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验,多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

血清肌酐检测结果：建模后24 h：四组血清肌酐值差异无统计学意义 （P＞0.05）；建模后48 h：与正常对照组及N-乙酰半胱氨酸对照组比较，对比剂损伤组、治疗组血清肌酐值均显著增高（P＜0.01）； 与治疗组比较，对比剂损伤组血清肌酐值升高更加明显,差异均有统计学意义（P＜0.01）。建模后72 h：与正常对照组、N-乙酰半胱氨酸对照组及治疗组比较，对比剂损伤组血清肌酐值显著增高,差异有统计学意义（P＜0.01）；正常对照组、N-乙酰半胱氨酸对照组及治疗组相比差异无统计学意义 （P＞0.05）。图1

图1 四组大鼠建模后不同时间点血清肌酐值

HE染色检测肾小管损伤程度：正常对照组肾小管上皮细胞无明显损伤，偶见单个肾小管上皮细胞脱落、再生现象，肾小管结构正常。对比剂损伤组建模后24 h可见少量肾小管上皮细胞空泡变性、刷状缘脱落、少数细胞脱落至小管腔，肾小管结构开始异常。建模后48 h可见大量肾小管上皮细胞刷状缘脱落、空泡变性、细胞脱落至小管腔，部分肾小管结构破坏。造模后72 h可见部分肾小管开始修复，损伤均减轻。三个时间点对比剂损伤组和治疗组肾小管损伤评分均较正常对照组和N-乙酰半胱氨酸对照组显著增高,差异均有统计学意义（P均＜0.05）；对比剂损伤组与治疗组比较, 对比剂损伤组升高更加明显，两组间比较差异也有统计学意义（P＜0.05） 。图2

图2 四组大鼠建模后不同时间点的肾小管损伤评分

肾组织氧化应激：与同时间点正常对照组和N-乙酰半胱氨酸对照组比较，对比剂损伤组和治疗组肾组织T-SOD活性均显著下降（P＜0.01），对比剂损伤组较治疗组下降更加明显， 差异均有统计学意义（P＜0.05）。与同时间点正常对照组和N-乙酰半胱氨酸对照组比较，对比剂损伤组和治疗组肾组织丙二醛含量均显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.01）,对比剂损伤组较治疗组升高更加明显 ，两组间比较差异也有统计学意义（P＜0.05）。表1

表1 四组大鼠建模后不同时间点肾组织 T-SOD 活性及丙二醛含量的比较

表1 四组大鼠建模后不同时间点肾组织 T-SOD 活性及丙二醛含量的比较

注： 与同时间点正常对照组和N-乙酰半胱氨酸对照组比较*P＜0.01；与同时间点治疗组比较△P＜0.05。T-SOD ：总超氧化物歧化酶

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3 讨论

对比剂肾病发病逐渐增多，已经成为了继低灌注和药物性肾损害之后院内获得性肾功能衰竭的第三大原因，一般人群发病率2%,在高危人群,如糖尿病肾病、慢性肾功能不全、心功能不全等,其发病率达20%～50%[8]，目前最有效的治疗方法是水化疗法，但对于心功能不好，无法承受大量液体补充者，药物预防对其相当重要。临床试验防治对比剂肾病，由于例数有限，试验结果不同，其仍在进一步研究中。大量实验表明再灌注后的活性氧释放造成了肾损害，早期抗氧化物质减少，氧化应激增强是对比剂肾病发生的重要机制之一[9]，本研究通过

建立大鼠低渗对比剂肾病模型，使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸早期干预，试图为对比剂肾病寻找有效的防治策略与方法。N-乙酰半胱氨酸在临床上主要作为一种疗效良好而且安全的黏液溶解剂用于多种呼吸系统疾病的治疗,迄今已有30多年的历史，随着对该药认识的不断深入，第一例关于N-乙酰半胱氨酸预防对比剂肾病的随机实验被报道，学者们展开了对N-乙酰半胱氨酸研究的热潮。本实验建立的大鼠低渗对比剂肾病模型肾组织病理切片HE染色可见：对比剂损伤组大鼠肾小管结构明显异常，肾小管上皮细胞空泡变性、坏死、脱落，而对照组肾小管间质结构无异常，无明显细胞坏死、脱落等表现，且对比剂损伤组肌酐值在对比剂使用后72 h内肌酐值的增高大于基线的25%，也说明我们的动物模型是成功的。通过抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对损伤模型干预，其HE染色镜下表现可见其组织损伤明显减轻，刷状缘脱失减少，细胞水肿及空泡均减少。氧化应激标志物T-SOD活性及丙二醛含量的变化也可以看出对比剂的使用使大鼠的肾脏氧化反应快速增加，氧化物与抗氧化物的失衡使肾损伤剧烈，N-乙酰半胱氨酸的使用显著改善了肾脏氧化应激反应。推断抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可能依靠直接减弱其氧化应激反应，改变肾脏血流动力学而起到防治对比剂诱导的急性肾损伤。Levin等[10]发现N-乙酰半胱氨酸的生物作用，提出它可能可以减轻对比剂诱导的肾小球或肾小管损伤。动物实验证明，N-乙酰半胱氨酸抑制谷胱甘肽转移酶，使局部组织的谷胱甘肽水平增高，发挥其抗氧化和自由基清除作用，还能增加肾脏一氧化氮合酶含量使一氧化氮产生增多，引起血管舒张，预防对比剂肾病的发生。N-乙酰半胱氨酸对慢性肾病高风险患者组SrCr≥1.4 mg/dl，尤其对不能水化的患者的临床治疗获得了一定的地位，当慢性肾病的患者在行冠状动脉介入前服用N-乙酰半胱氨酸其对比剂肾病的发生率可以显著下降（5.1% vs 23.8%）[11]。Marenzi等[12]认为N-乙酰半胱氨酸可以在缺血和再灌注引起的氧化应激中起保护作用。多项研究发现N-乙酰半胱氨酸可能依靠改变肾脏血流动力学，直接减弱其氧化应激反应而起到防治对比剂诱导的急性肾损伤[12,13]。随着一些实验的陆续完成，却得到了不同的结果[14,15]，N-乙酰半胱氨酸对肾脏保护作用的证据仍有限，争议仍未解决。

对比剂肾病的发生及发展尚未被充分认识，其影响因素众多，研究也日益增多[16]。由于其肾损伤是不可逆转的，所以在进行治疗前，我们应充分考虑患者应用对比剂的必要性，根据危险因素评分对患者进行评估，对于必须使用的患者术前应充分水化，或进行预防药物的使用，术中应尽量减少对比剂的用量和使用次数，在术后应注意监测肾功能的改变，预防对比剂肾病的发生。

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Effect of N-acetylcysteine Intervention on Contrast-induced Kidney Injury in Experimental Rats

WANG Lin, LI Wen-hua, CHEN Jing, HE Hai-yan, YU Ya-ren.
Department of Cardiology, Affliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou (221002), Jiangsu, China

Objective: To observe the effect of N-acetylcysteine (NAC) intervention on contrast-induced acute kidney injury in experimental rats, in order to provide the theoretical basis for treating such injury in clinical practice.

Contrast-induced nephropathy; N-acetylcysteine; Serum creatinine; Tubular injury

2014-05-26)

（编辑：汪碧蓉）

221002 江苏省徐州市，徐州医学院附属医院 心内科

王琳 住院医师 硕士研究生 研究方向为冠心病的基础研究 Email：xuyiwanglin2011@163.com 通讯作者：李文华

Email：xzwenhua0202@163.com

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1000-3614( 2015 )02-0168-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.02.018