西藏拉萨市城关区市售水果酵母菌的分离与鉴定

郭小芳 姚文娟 桑丁次措 邓茵 普布古吉 德吉

（西藏大学理学院 西藏拉萨850000）

西藏拉萨市城关区市售水果酵母菌的分离与鉴定

郭小芳 姚文娟 桑丁次措 邓茵 普布古吉 德吉

（西藏大学理学院 西藏拉萨850000）

开展酵母菌多样性研究，能够为酵母菌资源的开发与利用奠定基础。2015年4～7月，在拉萨市城关区水果市场购买12种水果，用捣碎法从水果表面及果肉分离酵母菌，结合经典分类法及26S rDNA D1/D2区域序列分析，对酵母菌菌株进行系统分类。酵母菌多样性指数的计算采用EXCEL数据处理软件按对应公式进行，采用SPSS 19.0软件统计分析不同水果酵母菌总丰度差异。结果显示：分离自拉萨市城关区12种市售水果的239株酵母菌归为隐球酵母属Cryptococcus、红酵母属Rhodotorula、德巴利酵母属Debaryomyces、有孢汉逊酵母属Hanseniaspora和锁掷酵母属Sporidiobolus等5个属10个种，其中浅黄隐球酵母Cryptococcusflavescens为优势种，其在供试水果中出现频率为100%，相对丰度约47%；不同水果酵母菌物种丰富度表明，杏和西瓜中酵母菌种类最多，其次为葡萄，柠檬和芒果则仅分离到一种；酵母菌总丰度差异性分析显示，哈密瓜中酵母菌数量最多，苹果中则最少；Shannon-W iener多样性指数（H′）、Pielou均匀度指数(J′)及Simpson多样性指数（D）显示，杏、梨和葡萄中酵母菌多样性最丰富，柠檬和芒果中最少。研究显示供试水果酵母菌群落间存在一定差异。

拉萨；水果；酵母菌；多样性；26SrDNA D1/D2

受多种因素的影响，采后水果极易腐烂变质，导致巨大损失，其中侵染性病害是引起新鲜水果腐烂变质的主要原因[1]。控制水果采后病害最常用的方法是化学杀菌剂，但随着人们环保意识的增强和对食品安全的持续关注，利用拮抗微生物替代传统化学杀菌剂控制水果采后病害已成为研究热点[2]。拮抗细菌、放线菌等在内的很多微生物尽管具有较强的生防潜力，但安全性却令人担忧。酵母菌由于广泛分布于自然生态系统，且人类几乎每天会随食物摄取大量活酵母菌，却很少引起不适，因此拮抗酵母菌因不产生有害代谢产物、遗传稳定、抑菌谱广、适应能力强且生长迅速等特点，在控制水果贮藏期病害方面显示

出巨大的潜力和广阔的应用前景[3]。目前，对于拮抗酵母菌的研究存在研究地区不广泛等现象，而且一些酵母菌存在对环境适应能力差等现象，极大地限制了具有优良生防活性的酵母菌的筛选与应用。

青藏高原是世界上海拔最高的生态系统，高寒、缺氧、辐射强等因素相互作用形成了青藏高原独特的自然地理环境，同时孕育了丰富且特殊的微生物资源[4]。本研究旨在开展拉萨市城关区市售水果酵母菌多样性研究，为青藏高原酵母菌资源的开发利用提供依据，并为产胞外酶及具有生物防治效果的活性酵母菌的筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 水果

2015年4～7月，在拉萨市城关区水果市场购买12种水果，包括苹果、梨、柑橘、香蕉、柠檬、番茄、哈密瓜、芒果、桃、葡萄、杏和西瓜。

1.1.2 培养基

酸化YPD培养基和酸化PDA培养基，具体配制参考严亚萍等[5]的方法进行。

1.2 酵母菌的分离纯化

用无菌小刀取水果果皮和果肉各10g，捣碎后分别置于盛有100ml无菌水的三角瓶中，振荡10min，分别接种0.2ml果汁悬液于酸化YPD培养基和酸化PDA培养基上，涂匀，每个处理重复3次。室温培养3-4d后，进行酵母菌菌落计数 ，并挑取菌落接种于YPD斜面。酵母菌菌株的纯化采用平板划线法。

1.3 酵母菌的分类鉴定

分离获得的酵母菌采用经典分类法[6]进行形态学观察，并结合26SrDNA D1/D2区域序列分析进行分类鉴定。

1.3.1 基因组DNA的提取：参照Kurtzman etal[7]方法提取。

1.3.2 PCR扩增与测序：26S rDNA D1/D2区域序列的PCR扩增和测序参照Nisiotou etal[8]的方法。用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)扩增所分离菌株的26S rDNA D1/D2区域。PCR扩增程序为：94℃、5min，94℃、1min，56℃、1min,72℃、1.5min，共进行35个循环；72℃、10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。所得产物送上海生物工程有限公司进行测序。

1.3.3 序列分析：供试菌株26S rDNA D1/D2测序结果采用DNAStar软件进行图谱分析，对序列进行人工校对，校正后的序列在GenBank核酸序列数据库(Nucleotide)中进行同源性搜索(BLAST search)，选取与供试菌株关系较近的模式菌株的26S rDNA D1/D2区序列比较其相似程度[9]。

1.4 数据处理

Shannon-Wiener多样性指数(H′)、Pielou均匀度指数(J′)及Simpson多样性指数(D)等酵母菌多样性指数采用EXCEL软件进行计算；不同水果酵母菌总丰度差异性分析采用SPSS 19.0的Duncan检验法；计算不同水果间酵母菌Jaccard相似性系数。酵母菌多样性指数主要包括物种丰富度、酵母菌总丰度、出现频率、相对丰度、Shannon-Wiener多样性指数(H′)、Pielou均匀度指数(J′)及Simpson多样性指数(D)等。

其中：物种丰富度指从某一水果分离的酵母菌物种数；酵母菌总丰度指某一水果分离的酵母菌数量，即每克水果中分离到的酵母菌菌落数，用cfu/g表示；出现频率为某一种酵母菌出现的水果种数占所有水果种类的百分比；相对丰度指某一种酵母菌菌株数占所有酵母菌菌株数的百分比。即

N为从某一水果表面及果肉中分离的酵母菌总株数；Pi为某一水果第i种酵母菌菌株数与该水果酵母菌总株数的比值。

Jaccard相似性系数为两种水果共有的物种数与两种水果酵母菌物种数并集的比值。

2 结果分析

2.1 拉萨市城关区市售水果酵母菌群落组成分析

表1 拉萨市城关区市售水果酵母菌种群分布

结合经典分类法及26SrDNA D1/D2区域序列分析法将分离自拉萨市城关区12种市售水果表面及果肉的239株酵母菌归为5个属10个种。结果显示（见表1），其中的21株属于子囊菌酵母（2个属2个种），占分离菌株数的8.78%；218株为担子菌酵母（3个属8个种），占91.2%。可以看出，12种水果中担子菌酵母菌占明显优势。

表1数据表明，获得的隐球酵母属Cryptococcus种类最多，为4个种，其次为红酵母属Rhodotorula为3个种，锁掷孢酵母属Sporidiobolus、有孢汉逊酵母属Hanseniaspora和德巴利酵母属Debaryomyces均为1个种。

分析10种酵母菌在供试水果中的分布情况，可以看出（见表1），浅黄隐球酵母Cryptococcus flavescens出现频率最高，为100%，其次为粘红酵母Rhodotorula glutinis（58.3%），Cryptococcus adeliensis、葡萄有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum和禾本红酵母Rhodotorula graminis在12种水果中的分布也较广，出现频率均大于30%。相对而言，Cryptococcus victoriae分布不太广泛，主要存在于苹果和香蕉。Sporidiobolus pararoseus和胶红酵母Rhodotorulamucilaginosa两种酵母菌出现频率最低，前者仅从杏中分离到，后者则仅存在于西瓜中。

酵母菌属水平相对丰度数据显示（见表1），隐球酵母属Cryptococcus相对丰度最高，为66.15%，其次

为红酵母属Rhodotorula为24.69%，锁掷孢酵母属Sporidiobolus和有孢汉逊酵母属Hanseniaspora相对丰度最低且均为0.42%。由此可看出，隐球酵母属Cryptococcus和红酵母属Rhodotorula是拉萨市城关区市售常见水果酵母菌的优势属。

分析酵母菌种水平总相对丰度，可以看出，浅黄隐球酵母C.flavescens相对丰度最高，为46.9%，其次为粘红酵母Rh.glutinis（15.9%），C.Carnescens、禾本红酵母Rh.Graminis、C.adeliensis及葡萄有孢汉逊酵母H.uvarum相对丰度也较高，约为8%。胶红酵母Rh，mucilaginosa和S.pararoseus均分离到1株，相对丰度仅为0.42%。酵母菌出现频率和总相对丰度数据表明，浅黄隐球酵母C.flavescens为供试12种水果酵母菌优势种。

另外，比较12种水果酵母菌群落组成情况，可以看出，浅黄隐球酵母C.flavescens是香蕉、柠檬、番茄、哈密瓜、芒果、桃、杏及西瓜等8种水果的主要酵母菌。除浅黄隐球酵母C.flavescens之外，禾本红酵母Rh. graminis在杏中分布数量也较多。葡萄有孢汉逊酵母H.uvarum和禾本红酵母Rh.graminis是葡萄的主要酵母菌。苹果的优势酵母菌则为C.carnescens，而梨和柑橘中分布的酵母菌主要为粘红酵母Rh.glutinis。2.2拉萨市城关区市售水果酵母菌组成相似度分析

表2 拉萨市城关区市售水果酵母菌Jaccard相似性系数

为比较供试的不同水果酵母菌物种组成的相似性，计算了水果间酵母菌物种Jaccard相似性系数。从表2可以看出，12种水果酵母菌Jaccard相似度系数介于0.14和1之间。芒果和柠檬、番茄和哈密瓜的酵母菌物种相似度最高，相似性系数为1，而杏和番茄、杏和哈密瓜的相似度最低，仅为0.14。除此以外，芒果和柠檬与杏和西瓜的相似度也较低，系数仅为0.17。总之，除一些水果间酵母菌群落组成相似外，供试的大多数水果间酵母菌组成存在不同程度的差异。

2.3 拉萨市城关区市售水果酵母菌多样性指数分析

表3数据显示，杏和西瓜酵母菌物种丰富度最高，从中均分离到6种酵母菌，其次是葡萄（5种），而柠檬和芒果中仅分离到1种酵母菌，分布的酵母菌种类最少。

酵母菌总丰度显示（见表3），哈密瓜中分布的酵母菌数量明显高于其他水果，为6.01×104cfu/g；苹果酵母菌总丰度相对最低，虽与柑橘、芒果等5种水果无显著差异（P＞0.05），但是明显低于其他6种水果的酵母菌总丰度（P＜0.05），仅为8×102cfu/g。

Shannon-Wiener多样性指数（H′）、Pielou均匀度指数(J′)及Simpson多样性指数（D）显示（见表3），杏、梨和葡萄中酵母菌多样性最丰富，分布也相对均匀，其中杏和梨的H′和D约为1.16和0.67；柑橘和桃的酵母菌多样性也较丰富，而柠檬和芒果的多样性指数最低。

表3 拉萨市城关区市售水果酵母菌多样性指数

3 讨论

为初步探讨青藏高原气候条件对水果酵母菌群落结构的影响，拟就内地水果与本研究供试对应水果酵母菌种类进行比较。来自兰州水果市场的红富士和烟台安德利果汁有限公司果汁生产线苹果中的酵母菌主要包括假丝酵母属Candida、克勒克酵母属Kloeckera、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、出芽短梗霉Aureobasidium pullulans及皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum等[10-11]，而本研究从苹果中获得的酵母菌则为隐球酵母属Cryptococcus的三种酵母和粘红酵母Rh.glutinis。分离自芒果的酵母菌为尼泊尔德巴利酵母D.nepalensis、Hanseniaspora opuntiae和异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus[12-13]，而本研究从芒果中分离到的酵母菌为浅黄隐球酵母C.flavescens。研究表明[14]，分离自四川自贡市场柑橘的酵母菌主要包括Candida quercitrusa、蜜二糖假丝酵母C.melibiosica、毕赤酵母属Pichia以及异常威克汉姆酵母W.anomalus，虽然从柑橘中也分离到4种酵母菌，但种类完全不同于文献显示的种类。另外，哈密瓜酵母菌主要为酿酒酵母S.cerevisiae和高里毕赤酵母p.guilliermondii[15]，本研究分离的酵母菌则是两种隐球酵母Cryptococcus。由于酵母菌在葡萄酒酿制中的重要作用，因此葡萄酵母菌种群分布研究很受注。研究表明，不同品种葡萄的酵母菌群落结构存在一定差异，霞多丽葡萄酵母菌主要为酿酒酵母S. cerevisiae、葡萄有孢汉逊酵母H.uvarum、浅黄隐球酵母C.flavescens、发酵毕赤酵母P.fermentans、拜耳接合酵母Z.bailiii、东方伊萨酵母I.orientalis及Candida zemplinina[16]，而西拉葡萄酵母菌则主要为葡萄有孢汉逊酵母H.uvarum、浅黄隐球酵母C.flavescens、浅白隐球酵母C.albidus、发酵毕赤酵母P.fermentans、发酵

接合酵母Z.fermentati及C.zemplinina[17]。宋育阳等[18]从神索葡萄中分离到葡萄有孢汉逊酵母H.uvarum、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri、C.zemplinina、酿酒酵母S.cerevisiae、巴氏酵母S.pastorianus等酵母菌。孙悦等[19]的研究结果则显示，梅鹿辙葡萄则以酿酒酵母S.cerevisiae、东方伊萨酵母I.orientalis、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri为主，这与本研究供试葡萄酵母菌群落组成有一定差异。综上所述，拉萨水果与内地对应水果的酵母菌群落组成存在显著差异，其原因一方面源于水果品种及微生物分离及培养条件等，也可能由于贮藏期环境条件对酵母菌种群结构产生了一定影响，进而导致分离的酵母菌间存在显著差异。

供试水果中，除西瓜为西藏林芝产以外，其他均来自于内地。来源于内地的水果不同于整个生长期均处于青藏高原的当地产水果，其中酵母菌可能主要为生长期附生的酵母菌，其群落结构与拉萨地区的气候等也许没有明显相关性。尽管如此，开展市售水果酵母菌多样性研究的重要性仍是不容置疑的，一方面，运达拉萨后水果所处环境会在一定程度上影响其表面酵母菌群落组成，低氧或寒冷环境也许能够促进某些与此环境相适应的具有特殊功能的酵母菌的生长或繁殖能力，从而易于分离，进而有利于具有特殊应用价值的酵母菌的开发。另外，本研究能够为拉萨乃至青藏高原不同生境或植物表面酵母菌多样性或资源的保护利用奠定基础。

4 结论

采用捣碎法从拉萨市城关区市售的12种水果中共获得239株酵母菌。结合经典分类和26S rDNA D1/D2区域序列分析法，将这些酵母菌归为5个属10个种。5个属中隐球酵母属Cryptococcus相对丰度最高，超过66%，其中浅黄隐球酵母C.flavescens在所有水果中均有分布，相对丰度约为47%，为供试水果的优势种酵母，而胶红酵母Rh.mucilaginosa和S.pararoseus数量最少，仅分离到1株。酵母菌多样性指数显示，杏、梨和葡萄中酵母菌多样性最丰富，而柠檬和芒果中酵母菌种类极少且分布不均匀。

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Isolation and Identification of Yeasts from Commercial fruits in Chengguan District in Lhasa

Guo Xiao-fang YaoWen-juan Sangding-Cicuo Deng-yin Pubu-Guji De-ji
(Schoolof Science,TibetUniversity,Lhasa 850000,China)

The research on the diversity of yeasts has been the foundation for the exploitation and utilization of yeast resources.Yeasts isolated from fruits surfacewere identified by 26S rDNA D1/D2 domain sequence analy⁃sis.Yeast diversity indices were calculated and the total abundance of yeast between different fruits was com⁃pared by Spass statistics 19.0.The results showed that 239 yeast isolates obtained from 12 kinds of fruitswere identified and belonging to 5 genera(Cryptococcus、Rhodotorula、Debaryomyces、Hanseniaspora and Sporid⁃iobolus)and 10 species,in which Cryptococcusflavescens was dominantspecieswith 100%ofoccurring frequen⁃cy and 47%of relative abundance;the highest species richness of yeasts found in apricot and watermelon fol⁃lowed by grape.However,only one strain found in lemon andmango.The analysis of yeast total abundance dis⁃played that themaximum number of yeast found in Hamimelon,the highest yeast diversity found in apricot, pearand grapeand the lessdiversity found in lemon andmango.The study showed thatdifferentyeasts communi⁃ty existed in various fruits.

Lhasa;fruit;yeast;diversity;26S rDNAD1/D2

10.16249/j.cnki.54-1034/c.2015.02.004

Q949.32

A

1005-5738(2015)02-021-07

[责任编辑：索郎桑姆]

2015-09-08

2014年度西藏自治区大学生创新实验训练计划项目“拉萨城关区市售水果中的酵母菌的生物防治效果初探”阶段性成果，项目号：2014QCX016

郭小芳，女，汉族，甘肃兰州人，西藏大学理学院副教授，主要研究方向为微生物生态学。