大孔树脂纯化飞龙掌血总生物碱的工艺研究

刘思艺

广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006

飞龙掌血又名见血飞，为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血(Toddalia asiatica Lam)的干燥根或根皮，始载于《植物名实图考》，是贵州苗族习用药材。其味辛，微苦，性温;入肝、肺经。临床主要用于感冒、胃气痛、胸胁痛、风湿性关节炎、跌打损伤、月经不调、劳伤吐血、疮疖肿痛、毒蛇咬伤、外伤出血等［1-2］。现代研究表明其具有抗A 型流感病毒活性、抑制白色念珠菌、痢疾杆菌等细菌、抗心肌缺血等作用［3-6］，研究前景广阔。总生物碱作为其一个有效部位群，占药材分离物的54.5%［7］，有明显的抗炎、镇痛、止血活性［8-9］，目前尚无优选飞龙掌血总生物碱富集纯化研究的报道。酸性染料比色法可对总有效部位进行含量测定，已有用于飞龙掌血提取物中总生物碱含量的测定［10］。本实验系统考察7 种大孔树脂对飞龙掌血总生物碱的吸附、解吸性能，并对筛选出的AB-8 树脂的纯化工艺做进一步的研究，确定了适宜的吸附、解吸的工艺条件。

1 材料与仪器

1.1 仪器 WFZ UV-2100 型紫外-可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司);XS225A 型分析天平(瑞士普利赛斯公司);GKC21CR4 型可控硅恒温水浴锅(上海锦屏仪器仪表有限公司);MD200-2 型氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料 柠檬酸固体、溴百里香草酚蓝、十二水磷酸氢二钠(天津市大茂化学试剂厂);乙醇、甲醇(天津市百世化工有限公司);三氯甲烷(衡阳市凯信化工试剂有限公司);氢氧化钠(广州市海珠区化学试剂厂);无水硫酸钠(天津市致远化学试剂有限公司)，所用试剂均为分析纯。DA-201、NKA-II、DM-301、DM-130、NKA-9、AB-8、D-101 大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)。

1.3 药品 盐酸小檗碱对照品(批号:0713-200208，中国药品生物制品鉴定所);飞龙掌血药材购自广州致信中药饮片有限公司，经广州中医药大学周劲松副教授鉴定为芸香科植物飞龙掌血Toddalia asiatica Lam 的干燥根。

2 方法与结果

2.1 分析方法［10］

2.1.1 对照品溶液的制备 取小檗碱对照品适量，精密称足，置称足量瓶中，加甲醇溶解并稀释成每1ml 含小檗碱50μg 的对照的溶液。精密吸取浓度为50μg·ml-1小檗碱对照品溶液3.0ml，空气吹干后精密加入酸性染料溶液4.0ml 及4.0ml 缓冲液，用10.0ml 氯仿萃取，加少量无水硫酸钠吸水。

2.1.2 阴性溶液的制备 精密吸取酸性染料溶液4.0ml 及缓冲溶液4.0ml，加10.0ml 氯仿萃，加少量无水硫酸钠吸水。

2.1.3 供试品溶液的制备 按单因素考察和正交试验得出的提取方法，取飞龙掌血药粉(40 目)约10g，25 倍量75%乙醇，75℃水浴回流提取40 min，提取液浓缩至无醇味，取上清液，稀释至适宜的质量浓度，备用。精密吸取原液。经静态和动态吸附后药液适量，20ml 量瓶中按对照品溶液的制备方法项下操作。

2.1.4 波长选择 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液进行全扫描，记录吸收曲线，对照品和供试品的吸收曲线形状一致，均在波长418nm 处有最大吸收，阴性溶液无干扰，故选择418nm 为测定波长。

2.1.5 标准曲线的绘制 精密吸取盐酸小檗碱对照品储备液(50μg·ml-1)0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6ml 于锥形瓶中，自“空气吹干”按“对照品溶液的制备方法”操作，418nm 处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.044X+0.050，r=0.9991。线性范围2.87～22.91μg·ml-1

2.1.6 测定方法 精密吸取原液、经静态和动态吸附后药液适量，置20ml 量瓶中，按“标准曲线的绘制”项下操作，计算总生物碱的量。

2.2 树脂的筛选

2.2.1 树脂的预处理 分别取上述7 种大孔吸附树脂，在使用前一晚用蒸馏水浸泡洗至无醇味，备用。

2.2.2 碱静态吸附率比较 精密称取各树脂2.5g (湿重)，置150ml 具塞三角瓶中，加入制备好的样品溶液 (0.4 g/mL)20ml，置于恒温摇床中振摇24h 后，测定样品液中总生物碱含量，计算树脂吸附率。上述7 种树脂吸附后，依次加入水10mL、75%乙醇25ml ×2 次，置于恒温摇床中依次振摇24h，测定各解吸液中总生物碱含量，计算解吸率。结果见表1。综合考虑吸附率和解吸率，选用AB-8型大孔树脂作为总生物碱纯化的载体。

2.3 AB-8 型大孔树脂纯化飞龙掌血总生物碱工艺参数

2.3.1 浓度对树脂吸附率的影响 取预处理树脂适量(相当于干树脂约1.0g)，精密称定，分别加入0.2、0.4、0.6 g/ml 的样品液20.0ml，置于恒温摇床中振摇24h，测定树脂的静态吸附率，吸附率分别为75.62%，50.00%，54.52%。因此飞龙掌血总生物碱的最佳吸附浓度为0.2g/ml。

表1 不同型号大孔吸附树脂对总生物碱吸附与解析结果

2.3.2 pH 值对树脂吸附率的影响 将浓度0.2g/ml 样品溶液调成pH 值为4.0、5.0 (原液)、6.0、7.0 和8.0 的溶液，分别精密吸取20.0ml，置装有预处理树脂(相当于干树脂约1.0g)的具塞三角瓶中，恒温摇床中振摇24h，测定 树 脂 的 静 态 吸 附 率，分 别 是 79.24%、82.94%、83.29%、80.82%、79.14%，上样液最佳pH 值为5.0～6.0，用原药液上样即可。

2.3.3 树脂静态吸附平衡曲线的测定 取预处理树脂适量(相当于干树脂约1.0g)，精密称定，加入浓度0.2g/ml 样品液20ml，置于恒温摇床中振摇，分别于0.5、1、2、3、4、6、8、12、24h 取样，测定AB-8 大孔树脂对总生物碱的吸附率，以吸附率对时间作图，绘制AB-8 树脂对总生物碱的静态吸附平衡曲线。由图1 可知，吸附4h 后树脂对总生物碱吸附率基本不再变化，说明AB-8 型树脂对总生物碱的吸附速度较快，4h 即达到吸附平衡。

2.3.4 流速对树脂吸附量的影响 将等量的0.2g/ml 样品液分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h 的流速通过树脂层析柱，考察不同流速对树脂吸附量的影响。结果吸附量依次 为88.34、87.66、87.82、84.95、74.77mg/g，表 明AB-8 型树脂对总生物碱的最佳吸附流速为3BV/h。

2.3.5 总生物碱在AB-8 树脂上的泄露曲线 将0.2g/ml的样品溶液加到AB-8 树脂层析柱中进行动态吸附，流速3BV/h，按保留体积分段收集流出液，并测定各段流出液中总生物碱的浓度，以流出液中总生物碱浓度对上样体积作图，绘制泄露曲线。由图2 可知，第9个保留体积液中总生物碱明显增多，说明上样至第8个保留体积时总生物碱开始明显泄漏。综合考虑，选择上样量为8BV。

2.3.6 洗脱方法的考察 向充分吸附飞龙掌血提取液后的AB-8 大孔树脂中加入2BV 水，置于恒温摇床中振摇24 h后，测定水解析液中总生物碱含量。再向水解吸后树脂中依次加入各5BV 不同浓度的乙醇 (10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)，同法操作，测定醇解析液中总生物碱的含量，结果见表2。考虑成本，确定洗脱方法为水洗脱后，依次用5BV 10%、20%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脱。

表2 不同洗脱液对总生物碱解析率结果

2.4 工艺验证 根据上述确定的树脂类型和工艺条件，用3 根树脂柱同时进行纯化试验，初步确定飞龙掌血生物碱纯化工艺为:采用AB-8 大孔树脂，湿法装柱，上样药材浓度为0.2g/ml，pH 值5.0～6.0，药材与干树脂质量之比为2.3∶1，室温下以3.0 BV/h 的体积流速进行吸附饱和。解吸时，先以2BV 的水洗脱(弃去)，再依次用5BV 10%、20%、30%、40%、50%、60% 乙 醇 洗 脱。吸 附 率80.27%，解吸率为72.87%，生物碱纯度从9.15%提高至为39.09%，工艺稳定可行。

3 讨论

本文围绕大孔树脂纯化的“上样-吸附-洗脱”步骤进行考察，设定的工艺参数便于实际操作与应用。醇解吸前先用水洗脱杂质、色素等，但水对飞龙掌血生物碱有一定的解吸作用，为了生物碱收率需要控制洗脱用水量。其结果表明试验方案证可行，对工业生产有一定指导意义。

在酸性染料法测总生物碱含量的操作时应注意避光，且不同pH 对结果影响较大。在预实验中对缓冲溶液的pH值进行了考察，配制pH 分别为4、4.5、5、5.5 的缓冲溶液，在其他条件相同时对同提取液进行萃取分离，检测其含量，结果显示当pH 为5.5 时总生物碱的含量最高，所以严格控制水相pH 为5.5。

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