HPLC 法测定复方龙血竭胶囊中五种皂苷含量

徐士奎 罗艳秋 覃 安

1.云南省食品药品检验所，云南 昆明 650011;2.云南中医学院，云南 昆明 650500;3.云南财经大学，云南 昆明 650504

复方龙血竭胶囊是由冰片、龙血竭、三七加工制成的纯中药制剂，具有活血化瘀、定痛止血、敛疮生肌等功效，主要用于跌打损伤、瘀血作痛、气血凝滞、外伤出血、脓疮久不收口及冠心病、心绞痛、心肌梗塞、血瘀证等心脑血管疾病。现行质量标准用三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等三种对照品对其进行含量测定，检测成本较高且操作繁琐，为节约检测成本和有效控制药品质量，本研究探索用三七总皂苷对照提取物作为对照物质建立高效液相色谱方法，为复方龙血竭质量控制提供依据。

1 仪器、试药与样品

1.1 仪器 岛津LC-20A 高效液相色谱仪(日本岛津公司)，检测器:SPD-20A (D2+W));紫外分光光度计(岛津UV-2550);分析天平(Denver TB-215D，十万分之一);分析天平(SartorIUS BS224S，万分之一)

1.2 试药 对照品为三七总皂苷对照品(中国药品生物制品检定所，10870-201002，以三七皂苷R16.9%、人参皂苷Rg128.0%、人参皂苷Re 3.8%、人参皂苷Rb129.7%、人参皂苷Rd 7.3%计);方法学研究用复方龙血竭胶囊样品均由云南云河药业有限公司提供;乙腈由Merck 公司生产，色谱纯;水为超纯水;磷酸为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱。检测波长为203nm。

表1 梯度洗脱方法

2.2 对照品贮备溶液的制备 精密称取三七总皂苷对照品99.87mg，置25ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1ml含三七皂苷R10.27564mg、人参皂苷Rg11.11854mg、人参皂苷 Re 0.15180mg、人参皂苷 Rb11.18646mg、人参皂苷Rd 0.29162mg 的对照品溶液，作为储备液。对照品HPLC 图谱见图1。

2.3 供试品溶液制备 取本品装量差异项下的内容物，研细，精密称取约0.75g，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，振摇30min，称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。样品HPLC图谱见图2。

2.4 阴性供试品溶液制备 按处方量取缺三七的其余药材模拟制剂工艺制备阴性样品，由云南云河药业有限公司制备。取阴性样品0.75g 按2.3 项下供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。阴性样品HPLC 图谱见图3。

2.5 方法学考察［1］

2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取储备液加甲醇制成系列浓度的混合对照品溶液(见表2:标准品的配制浓度)，分别精密吸取10μl 注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品浓度X 为横坐标，峰面积积分值Y 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程如表3 所示。

表2 标准品的配制浓度 /mg/ml

表3 线性关系

研究结果表明5 种成分在各自线性范围内，浓度与峰面积均呈现良好的线性关系。

2.5.2 仪器精密度实验 取同一对照品溶液(三七皂苷R1浓度0.166mg/ml;人参皂苷Rg1浓度0.671mg/ml;人参皂苷Re 浓度0.0912mg/ml;人参皂苷Rb1浓度0.712mg/ml;人参皂苷Rd 浓度0.175mg/ml)，按照2.1 项下的液相色谱条件重复进样6 次(n=6)，每次进样10μl，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 峰面积的RSD 值分别为1.34%、1.43%、1.20%、1.39%、1.41%，均＜2%，表明仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性实验 精密称取复方龙血竭胶囊样品细粉0.75g，按2.3 项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μl 分别在0、10、20、30、40、50h 后进样，按照2.1 项下的色谱条件依法测定，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 的RSD 分别为1.27%、1.40%、1.19%、1.33%、1.39%，表明供试品溶液在50 小时内基本稳定。

2.5.4 重复性实验 精密称取同一批次复方龙血竭胶囊样品细粉6 份，按2.3 项下供试品溶液制备方法处理后进行含量测定，按照外标法计算各样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 的含量，RSD 值分别为0.34%、0.25%、0.80%、1.24%、0.79%，说明该方法重复性良好。

2.5.5 耐用性试验 取样品溶液，分别对不同品牌、不同规格的色谱柱及不同柱温进行优化测定，结果表明对被测成分色谱峰的分离度及测定结果无明显影响。

2.5.6 回收率试验 精密称取含量已知的复方龙血竭胶囊细粉6 份，每份约0.375g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，分别精密加入三七总皂苷对照品适量，按2.3 项下供试品溶液制备方法及2.1 项下的色谱条件依法测定含量并计算回收率，三七皂苷R1平均回收率为101.042%，RSD=1.58%;人参皂苷Rg1平均回收率为100.39%，RSD=1.59%;人参皂苷Re 平均回收率为101.91%，RSD=1.02%;人参皂苷Rb1平均回收率为100.71%，RSD=1.58%;人参皂苷Rd 平均回收率为99.99%，RSD=1.29%，表明该方法的回收率良好，结果分别见表4、表5、表6、表7、表8。

表4 三七皂苷R1 回收率结果

表5 人参皂苷Rg1回收率结果

表6 人参皂苷Re 回收率结果

表7 人参皂苷Rb1回收率结果

表8 人参皂苷Rd 回收率结果

2.6 样品测定 分别称取三个不同批次复方龙血竭胶囊样品照上述色谱条件测定，结果见表6:样品测定结果。

表9 样品测定结果 /mg/g

3 结果与讨论

本实验用三七总皂苷对照提取物作为对照组，采取HPLC 法同时测定复方龙血竭胶囊中三七皂苷R1、人生皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 5个成分的含量，该方法分离度好、灵敏度高且稳定性好，快速、简便，同时可大大减少检测成本，不失为药品质量控制好的方法和思路。

药物疗效的发挥基于其化学物质基础，化学成分如何表征是其质量评价的关键问题。基于单个化学成分的表征逐渐被认识到违背中国传统医药学整体理念和思维体系，无法揭示物质基础-化学成分群的整体性和复杂性，而整体质量控制的思路越来越被广泛接收［2］，如何开发廉价、快速的化学表征技术方法是药品质量控制研究的重要内容。

［1］.国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.一部.北京:中国医药科技出版社，2010:附录130-131.

［2］.贺福元，邓凯文，石继连，等.中药有效成分群组方技术研究若干基础瓶颈问题及数理特征化思路的提出［J］.中药材，2009，32 (1):1-6.