HPLC-ELSD法测定金线草中β-谷甾醇和胡萝卜苷含量

樊宝娟，刘雪峰，曾爱国，常 春，傅 强

(1.西安交通大学医学部药学院;2.陕西省食品药品检验所，陕西 西安 710061)

金线草作为民间草药，最早被记载于《本草拾遗》，为蓼科金线草属植物金线草Antenoron filiforme(Thunb.)Roberty et Vautier，以根或全草入药［1］，具有凉血止血、清热利湿、散瘀止痛之功效，主治咯血吐血、胃痛、经期腹痛、产后血瘀腹痛、跌打损伤、风湿痹痛等［2］。赵友兴等［3］从金线草的乙醇提取物中一共分离并鉴定了11个化合物:谷甾醇、胡萝卜苷等。其中β-谷甾醇具有降胆固醇、抗癌、抗炎、止咳等作用［3］，胡萝卜苷在一定浓度下对经氧化损伤后的人微血管内皮细胞表现出很强的修复作用［4］。但金钱草中β-谷甾醇及胡萝卜苷含量测定方法尚且未见报道，因这两个成分除在紫外末端有吸收外，未见其他紫外吸收峰，用紫外法测定时，存在基线漂移不稳，响应值小等缺点。故本文采用HPLCELSD法［5-6］测定了金线草中β-谷甾醇和胡萝卜苷的含量，为金线草的药用开发提供实验数据。

1 仪器与试药

Waters2487-2996高效液相色谱仪，Alltech 2000ES蒸发光检测器，Empower色谱工作站(美国沃特世公司);Sartorius BS224S电子天平(德国赛多利斯公司)。对照品及对照药材均由中国食品药品检定研究院提供:β-谷甾醇 (批号:110851-200504);胡萝卜苷(批号:100445-200601);甲醇为色谱纯(美国天地公司)，水为超纯水，其他试剂为分析纯。金线草药材自采于陕西秦岭和巴山地区。共8批样。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇—水(96∶4);体积流量 1.0 mL·min-1;柱温30℃，漂移管温度70℃，载气体积流量1.8 L·min-1，进样体积10μL。在上述条件下，供试品中β-谷甾醇和胡萝卜苷色谱峰与其他杂质峰可达到基线分离，分离度均大于1.5。见图1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取β-谷甾醇对照品和胡萝卜苷对照品7.64、5.08 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，制成质量浓度分别为76.4和50.8 mg·L-1对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，粉碎，取样品约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入丙酮50 mL，加热回流3 h，放冷，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇定容至5 mL，摇匀，即得。

2.3 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2、5、10、20、25 μL，在上述“2.1”色谱条件下测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标，绘制成标准曲线，求得β-谷甾醇对照品和胡萝卜苷回归方程分别为 Y=1.198X+2.076(r=0.999 5)、Y=1.287X+2.985(r=0.999 3)，线性范围分别为0.152 8 ～1.910 μg 和0.101 6 ～1.270 μg。

2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，考察其峰面积，结果6次β-谷甾醇峰面积的 RSD为1.33%，胡萝卜苷峰面积的RSD为1.09%，说明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 取同一批样品6份，精密称定，分别按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，β-谷甾醇和胡萝卜苷含量的RSD分别为0.98%和1.08%，结果表明样品重复性良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，20，24 h 测定，结果在 24 h 内，β-谷甾醇含量的RSD为1.17%，胡萝卜苷含量的RSD为1.05%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率实验 取已测得含量的样品6份各0.5 g，精密称定，分别精密加入一定体积的混合对照品溶液，挥干溶剂，再照供试品溶液同法制备，按“2.1”色谱条件进行测定，结果β-谷甾醇6份的平均回收率为99.7%，测得含量RSD为1.40%，胡萝卜苷6份的平均回收率为98.9%，测得含量RSD为 1.77%，见表 1。

表1 回收率试验结果(n=6)

2.8 样品测定 按上述“2.1”色谱条件及“2.2”样品处理方法，测定8批样品，结果含量见表2。通过含量测定结果可看出不同批次药材的β-谷甾醇及胡萝卜苷的含量差异较大，分析产生差异的原因可能是不同生长环境(气候、土壤、光照等)不同所致。所以加强药材来源管理和对药材质量进行控制是很有必要的。其有效成分含量高低与环境因素的相应关系，有待进一步研究证明。

表2 样品测定结果

3 讨论

3.1 提取溶剂的考察［7－8］本文曾参照相关文献［2］采用乙醇做为提取溶剂，但因其极性较大，对两个待测成分均提取率较低，又分别以甲醇、三氯甲烷、石油醚及丙酮作为提取溶剂，结果四种溶剂对同一批药材中β-谷甾醇的提取量分别为:0.124、0.204、0.209、0.205 mg·g-1，胡萝卜苷的提取量分别为:0.114、0.079、0.098、0.124 mg·g-1，表明丙酮对两个有效成分的提取效果均佳。因此，选择丙酮为提取溶剂。

3.2 提取方式的考察［9－10］分别采用加热回流、索氏提取、超声提取方法，结果三种提取方法对同一批药材中 β-谷甾醇的提取量分别为:0.205、0.207、0.189 mg·g-1，胡萝卜苷的提取量分别为:0.124、0.123、0.095 mg·g-1，表明索氏提取及加热回流提取方法对两个有效成分的提取效果均佳。考虑到节约实验时间，故选用加热回流提取方法。

3.3 流动相考察 β-谷甾醇和胡萝卜苷极性都比较小，故采用甲醇作为流动相，进行试验，结果出峰时间比较短，不易使样品达到完全分离，后采用不同比例的甲醇—水系统进行试验，结果采用甲醇—水(96∶4)为流动相，β-谷甾醇和胡萝卜苷能与样品中其他杂质峰完全分离，并且峰形良好，保留时间合适。

金线草在我国很多地区都有分布，因其具有祛风除湿，理气止痛，止血，散瘀等功效，在民间有一定应用，但因对其相关化学成分研究较少，从而限制了这一宝贵中药资源的有效开发利用。本文建立了该药材中的β-谷甾醇和胡萝卜苷定量分析方法，该方法准确可靠，专属性好，重复性好，为进一步开拓金线草药材的应用领域奠定了基础。

［1］湖北省卫生局.湖北中草药志(二)［M］.武汉:湖北人民出版社，1982:633.

［2］国家中医药管理局《中华本草》编委会编.中华本草［M］.第六卷第二册.上海:上海科学技术出版社，1999:627.

［3］赵友兴，李红芳，马青云，等.金线草化学成分研究［J］.中药材，2011，34(5):704-707.

［4］蒋小华，宾祝芳，谢运昌，等.HPLC-ELSD法同时测定红丝线中的豆甾醇和 β-谷甾醇［J］.中成药，2013，35(8):1711-1713.

［5］何秋艳，翁新楚.山楂活性成分对氧化低密度脂蛋白损伤人微血管内皮细胞的防治作用［J］.上海大学学报(自然科学版)，2007，13(6):751-756.

［6］叶 燕.HPLC-ELSD法测定牛黄降压丸中黄芪甲苷的含量［J］.安徽医药，2014，18(4):618-620.

［7］程世云，徐国兵.HPLC-ELSD法测定复方麝香注射液中聚山梨酯80 的含量［J］.安徽医药，2014，18(3):458-460.

［8］闫雪生，徐新刚，李 霞，等.HPLC-ELSD法测定柏子仁霜中胡萝卜苷的含量［J］.中国药房，2011，22(15):1383-1384.

［9］严晓明，黄英栋，林晓辉，等.高效液相色谱法测定妇科止带胶囊中 β-谷甾醇的含量［J］.中南药学，2013，11(7):544-546.

［10］底雪梅，阎福林.毛叶香茶菜化学成分研究［J］.安徽医药，2013，17(9):1470-1472.