大鼠甲醇中毒后体内的甲酸分布

刘冬梅，周姝，陈捷敏，夏文涛

（1.上海华医司法鉴定所，上海 200335；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海 200063）

大鼠甲醇中毒后体内的甲酸分布

刘冬梅1，2，周姝2，陈捷敏2，夏文涛2

（1.上海华医司法鉴定所，上海 200335；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海 200063）

目的研究大鼠甲醇中毒后血液及体内主要组织中甲酸的浓度及分布特点。方法将SD大鼠分为对照组、中毒3d组和中毒7d组，中毒模型按照首剂量8mL/kg给予大鼠甲醇灌胃，24h后给予减半剂量4mL/kg再次灌胃，在首次灌胃后的3d和7d将大鼠引颈处死，采心血并提取肝、肾、脑、心和胃组织，利用高效液相色谱仪检测其中的甲酸含量。结果甲酸在组织中的浓度高于血液中；与中毒3d组比较，中毒7d组脑和胃组织内的甲酸质量浓度有一定的增加趋势，而肝和肾组织中的甲酸质量浓度有所下降（P<0.05）。结论高效液相色谱法可以作为一种准确检测甲酸的定性定量方法。大鼠甲醇中毒后，其代谢产物甲酸在血液及组织中均有蓄积，在器官组织中的蓄积更显著。

法医毒理学；中毒；甲醇；甲酸；高效液相色谱法；组织分布

甲醇中毒事件常呈现群体性爆发，时间与地区分布也相对集中，可能引起严重的民事纠纷甚至刑事诉讼。鉴于其损害后果的严重性及社会影响的恶劣性，甲醇中毒的毒性机制受到了法医工作者的密切关注。

急性甲醇中毒后，甲醇在体内经过醇脱氢酶的催化作用被氧化为甲醛，甲醛在醛脱氢酶的催化作用下被氧化为甲酸[1]。研究[2]表明，甲醛和甲酸的毒性损害作用远远高于甲醇本身。虽然甲醛具有较大的毒性作用，但因其在体内停留时间极短暂，所以在甲醇中毒中，甲酸较甲醛发挥了更显著的毒性作用。目前对甲酸含量检测方法的研究仍不够成熟，且国内仅见关于血液和尿液中甲酸含量的报道[3-4]。国外有学者应用顶空气相色谱法分析尸体血液中的甲醇和甲酸，但该方法并未经过验证[5]。Morris[6]采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）在210 nm

吸收波长下检测到了蛋清溶液中的甲酸。本研究采用HPLC，优化了前处理过程，检测大鼠甲醇中毒后血液中甲酸含量，并对其分布特点进行研究，为甲醇中毒机制研究及法医毒理学鉴定提供一定的线索及依据。

1 材料与方法

1.1 甲醇中毒模型及分组

选择体质量200～250 g的健康雄性SD大鼠（由上海斯莱克实验动物有限公司提供）30只，分为对照组、中毒3d组和中毒7d组，每组10只大鼠。将实验动物饲养在标准温度和湿度的环境下，12h明暗交替的光照，不限食物与水的供给。将一氧化二氮与氧气的混合气体［V（N2O）/V（O2）=1∶1，由上海申通气体有限公司供给］按2 L/min的速度通入装有实验动物的密闭容器中，持续24h，使大鼠去叶酸化[7]。按照首剂量8mL/kg（介于中毒量和半数致死量）[8]给予大鼠甲醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯级）灌胃，对照组给予等量的生理盐水。24 h后给予减半剂量4mL/kg再次灌胃。甲醇首次灌胃后的3d和7d断颈处死，对照组在生理盐水灌胃后1 d处死，采心血置于经EDTA处理的抗凝管中，并提取肝、肾、脑、心和胃组织，置于-80℃冰箱保存。

1.2 仪器与分析方法

采用Thermo U3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司），色谱柱为Calesil ODS-100 C18柱（4.6mm×250mm，5μm），二极管阵列检测器（美国安捷伦公司），温度设置为室温，流动相为甲醇与超纯水的混合物［V（甲醇）/V（超纯水）=6∶4］，流速控制在1 mL/min，进样量为20 μL，检测波长设置为215 nm。Thermo Scientific Sorvall ST 40离心机（美国Thermo Fisher公司）。

配置一系列已知浓度的甲酸标准品（国药集团化学试剂有限公司，分析纯级）溶液，质量浓度分别为0.305、0.610、1.220、2.440mg/mL，绘制标准曲线。

1.3 样品前处理

在检测甲酸含量前，采用FastPrep-24样品处理系统（美国MP Biomedicals公司）处理组织，振荡速度设置为4.5m/s，时间为2～3min。将血液和研磨后的组织浆液样本以离心半径10cm，10000r/min，离心10min，按V（上清液）∶V（流动相）=6∶4混合均匀待进样。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 甲酸标准品的色谱峰与标准曲线

将甲酸标准品溶液进行HPLC检测，发现色谱峰的保留时间出现在1.98～2.07min（图1）。根据色谱峰面积（y）与甲酸质量浓度（x）绘制标准曲线：y=15.837x-6.647（R2=0.992）。

图1 甲酸标准品的色谱图

2.2 血液及组织中的甲酸含量

血液中甲酸的检测结果见图2，发现在2.02 min出现未知峰，通过与甲酸标准品进行比对，确定该未知峰为甲酸色谱峰。同样，在肝、肾、脑等组织中，在该时间点内亦检测到甲酸色谱峰。基于甲酸质量浓度标准曲线得到血液及肝、肾等组织中的甲酸含量，见表1。结果显示，甲酸在组织中的含量高于血液（P< 0.05）。与中毒3d组比较，中毒7d组的脑和胃组织内甲酸含量有一定的增加，而肝和肾组织中甲酸含量反而有所下降（P<0.05）。

图2 各组血液中甲酸的色谱图

表1 血液及组织中甲酸含量［n=10，mg/mL（mg/g）］

表1 血液及组织中甲酸含量［n=10，mg/mL（mg/g）］

注：1）与相同中毒时间血液中质量浓度相比，P<0.05；2）与中毒3d组相同组织中含量相比，P<0.05

组别血液肝肾脑心胃对照<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05中毒3d0.61±0.078.01±0.631）8.42±1.241）6.20±0.261）8.06±0.401）9.02±3.531）中毒7d0.60±0.056.58±0.821）2）6.80±2.061）2）7.69±2.521）2）7.94±0.961）10.09±5.311）2）

3 讨论

甲醇中毒对视网膜、视神经及神经系统具有明显的选择性毒性作用。据报道[9]，急性甲醇中毒后95.2%的患者出现不同程度的视力下降和眼底改变，76.2%表现以中枢神经系统损害为主的症状和体征。甲酸，俗名“蚁酸”，是无色而有刺激性气味的液体，易混溶于醇类等有机溶剂。作为甲醇的中间代谢产物，研究认为甲酸可通过抑制细胞色素氧化酶的活性，导致细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成的减少，从而引起乳酸酸中毒，酸中毒进一步加剧了超氧化物阴离子和自由基的产生，又反过来破坏线粒体和细胞膜的结构和功能[10]。另外，甲酸可引起组织缺氧，尤其是在脑、肾和心等需氧量大的器官[11]，其被认为是甲醇毒性作用中的关键成分[1]。国外学者Garner等[12]发现，大鼠甲醇中毒后，视网膜电图OPs波的潜伏期出现非选择性的延迟，振幅呈现不同程度的下降，且随着甲酸含量的升高，其振幅下降更明显。但也有学者[13]认为，甲醇中毒的眼部毒性作用源于甲醇的代谢产物——甲醛对视网膜的损害，而非甲醇和甲酸的毒性作用。Matsumoto等[14]对甲醇染毒后甲醛在兔体内的代谢进行研究发现，甲醛并没有在血液中蓄积或者与体内的蛋白质结合，而是被快速代谢为甲酸。在大鼠甲醇中毒以后，血液和尿液中甲酸含量分别是甲醛的30倍和29倍，且房水中甲酸含量最高，血液次之[15]。据此，甲酸在体内停留的时间比甲醛长，发挥的毒性作用也应比较显著，并且甲醇中毒的毒性作用大小与甲酸在体内的分布存在着一定的关联性。

高效液相色谱（HPLC），又称高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支。其以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。目前，HPLC已成为化学、医学、工业、农学、食品等领域中重要的分离、分析技术。Seme等[16]利用HPLC测定了大鼠甲醇中毒后72h内不同时间点血液中的甲酸含量，发现血液中甲酸含量呈线性增加，提示甲酸在大鼠体内代谢非常缓慢。

急性甲醇中毒往往在2～3 d后出现较明显的临床症状、体征，7d后随着甲醇的代谢，一部分症状及体征可能恢复，但神经系统、眼球等敏感器官可能会遗留一定程度的功能障碍。在前期研究[17]发现，甲醇中毒后3d和7d是研究大鼠中毒症状的有效时间，故本研究继续采用这两个时间点观察，并成功建立了典型的大鼠甲醇中毒模型。本研究中，将甲醇中毒后两个时间点不同组织内的甲酸含量进行比较后发现，甲酸在中毒3d和7d的大鼠血液及其他组织中代谢都较缓慢，浓度并未随时间的延长出现显著的下降，提示甲酸在甲醇中毒后存在一定的蓄积。相比较而言，组织中的甲酸含量明显高于血液中，考虑因血液属于机体的循环系统，可及时将包括甲酸在内的各类物质输送到相应的靶器官，故导致甲酸在各组织中的含量较血液中高，并继发各组织的结构破坏和功能损害。前期研究[17]对肝、肾的组织病理学检验也证实，甲醇中毒以后肝和肾的显微结构发生改变，表现为肾小球严重充血，肝小叶和肝窦扩张、充血，中央静脉充血等。甲醇中毒早期脑组织内的甲酸含量较其他组织略低，而在中毒7 d后，肝、肾等作为主要代谢器官，其中的甲酸含量存在一定的下降趋势，而脑组织内的甲酸含量却有升高趋势，所以，甲酸在神经组织中的蓄积作用可能更明显，甲酸对神经组织的损害作用也可能更为明显。因视网膜量少且提取困难，本研究未检测视网膜中的甲酸含量，但考虑视网膜及视神经同样为神经组织，故其中的甲酸分布可能与脑组织中的甲酸分布接近。在后续研究中，本研究小组拟改进视网膜组织的提取方法，扩大样本量，以研究甲醇中毒后甲醇及甲酸在视网膜及邻近组织中的分布情况。

在甲酸检测的前处理方法方面，与血液不同，肝、肾等致密组织中的甲酸分散在组织内部，普通的物理学方法很难将其完全释放出来，而FastPrep-24样品处理系统可以高效、快速、稳定地破碎各种类型样本制成组织匀浆，避免了研磨、匀浆、超声波处理等传统方法费力、耗时、高损耗及低效等诸多缺点。FastPrep-24系统的样品裂解在40 s内完成，对核酸和蛋白质几乎无破坏作用，并且因不产生热量，也不会使甲酸挥发而丢失。本研究采用该处理系统，将肝、肾等组织中的甲酸释放出来，是本研究的亮点之一。

深入研究甲酸在甲醇中毒机制中的作用，建立一

种能够稳定检测甲酸的分析方法十分关键。本研究结果证实，HPLC能够用于稳定地检测甲醇中毒后血液及组织中的甲酸含量，有望在以后的相关研究中推广使用。

FastPrep-24样品处理系统联合HPLC可以作为一种稳定、准确检测组织中甲酸的定性定量方法。大鼠甲醇中毒后，其代谢产物甲酸在血液及组织中均具有一定的蓄积作用，且相较血液在器官组织中的蓄积更显著，并且对神经组织的后期损害作用可能更为明显。

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Distribution of Formic Acid after Methanol Intoxication in Rats

LIU Dong-mei1,2,ZHOU Shu2,CHEN Jie-min2,XIA Wen-tao2
（1.Institute of Huayi Forensic Science,Shanghai 200335,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China）

Objective To investigate concentration and distribution in blood and tissues of formic acid after methanol intoxication in rats.Methods The Sprague-Dawley rats were divided into groups for control group and 3-day and 7-day intoxication treatment groups.The experimental groups were administered methanol by gavage with the initial dose of 8mL/kg and followed with 4mL/kg supplemental dose 24 h later.After 3 days and 7 days later,rats were killed by decapitation.Then samples of cardiac blood,liver,kidney,brain,heart and stomach of each group were collected.Formic acid concentrations were detected by high performance liquid chromatography.Results Formic acid concentrations in tissues were higher than in blood.Compared with 3-day intoxication group,there was an increase formic acid of concentration in brain and stomach in 7-day intoxication group,while a decrease in liver and kidney（P<0.05）.Conclusion High performance liquid chromatography could be used to accurately detect formic acid.As the metabolite of methanol,formic acid accumulates in rat blood and tissues after intoxication and the concentrations in organs and tissues are obviously higher than in blood.

forensic toxicology;poisoning;methanol;formic acid;high performance liquid chromatography;tissue distribution

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.009

1004-5619（2015）06-0450-04

2015-03-17）

（本文编辑：高东）（

2015-09-28）

上海市自然科学基金资助项目（14ZR1442400）；中央级公益基金资助项目（GY2013Z-1）

刘冬梅（1987—），女，硕士，主要从事法医临床学研究；E-mail：l_dm1987@163.com

陈捷敏，女，副主任法医师，助理研究员，主要从事法医临床学与法医毒理学研究；E-mail：chenjm@ssfjd.cn

通信作者：夏文涛，男，研究员，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医临床学的鉴定与研究；E-mail：xiawentao629@ 163.com