人工栽培欧李仁油的提取、成分分析及抗氧化性

高友君，任 清*

（北京工商大学食品学院，北京 100048）

人工栽培欧李仁油的提取、成分分析及抗氧化性

高友君，任 清*

（北京工商大学食品学院，北京 100048）

以欧李仁为原料，利用响应面法优化欧李仁油的提取工艺。在单因素试验的基础上，进行响应面分析，确定欧李仁油的最佳提取工艺条件为：液料比9.18∶1（mL/g）、提取时间5 h、提取温度57.7 ℃。在此条件下欧李仁油的提取率为84.57%。用气相色谱法对得到的精炼油进行脂肪酸成分分析，共检测出11 种脂肪酸，其中油酸63.0%、亚油酸30.7%。同时以对羟自由基及超氧阴离子自由基的清除效果来测定精炼欧李仁油的抗氧化性，结果表明，精炼欧李仁油质量浓度为0.7 mg/mL时，对羟自由基的清除率为90.28%；精炼欧李仁油质量浓度为1.2 mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率为92.60%。

欧李仁油；提取；响应面法；脂肪酸；抗氧化性

欧李（Prunus humilis Bunge）又称钙果，为蔷薇科樱桃属多年生落叶小灌木。欧李是我国特有的一种野生果树，栽培历史约3 000 a，主要分布在黑、吉、辽、宁夏、甘肃、山西、陕西、内蒙、河北、北京、天津、河南和山东13个省市自治区[1-3]。欧李仁为其种仁，可以入药，称为“郁李仁”，具有镇咳平喘、润肠通便等功效。其主要药效成分苦杏仁苷的含量为2%～5%，已被开发成针剂、片剂和粉剂等制剂[4-9]。欧李仁中蛋白质含量在30%左右，其氨基酸组成与大豆蛋白和花生蛋白相接近，但谷氨酸含量很高，远高于大豆蛋白和花生蛋白[10]。此外，其种仁中还含有40%的油脂，不饱和脂肪酸占90%以上，主要是油酸和亚油酸[11]。

欧李是一种野生果树，近年来经人工驯化、育种得到人工栽培种[12]。但目前对人工栽培种欧李仁油的提取、精炼及抗氧化活性的研究还未见报道。本实验以来源于北京中医药大学的人工栽培京欧1号的欧李仁为原料，对欧李仁油提取、精炼、脂肪酸成分分析及抗氧化活性进行系统的研究，旨在对欧李仁综合开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

京欧1号欧李仁 北京中医药大学。

石油醚（沸程30～60 ℃与60～90 ℃） 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、磷酸二氢钠、氢氧化钠北京化工厂；氢氧化钾、环己烷、冰乙酸、韦氏试剂、硫代硫酸钠、丙酮、乙醚、活性炭、铁氰化钾、磷酸氢二钠、三氯乙酸、硫酸亚铁、30%双氧水、水杨酸、氯化铁 天津市光复科技发展有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

索氏提取器、DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱、DK-S22型数显式电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DSHZ-300A水浴振荡器 太仓市实验设备厂；85-2恒温磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；紫外-可见分光光度计 北京普析通用有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种仁油的提取

称取20 g欧李仁粉，用滤纸包好，移入索氏提取器中，按一定的液料比加入沸程30～60 ℃石油醚于平底烧瓶，装好提取装置，于一定温度条件下恒温水浴，回流一定时间后，回收石油醚，得到浅黄色种仁油粗品；于105 ℃电热鼓风干燥箱中烘至质量恒定，取出冷却后称质量。按式（1）计算欧李仁油的提取率（种仁含油量依照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》[13]方法）。

1.3.2 单因素试验

在其他因素保持不变的情况下，以液料比、提取时间、提取温度为试验因素，以欧李仁油的提取率为试验指标，分别做单因素试验，分析各因素对欧李仁油提取率的影响。

1.3.3 响应面优化试验

结合单因素试验结果，采用Box-Behnken设计模型，以沸程60～90 ℃石油醚为提取剂，选择液料比（mL/g）、提取时间、提取温度为影响因素，以欧李仁油的提取率为响应值，采用三因素三水平的响应面法进行试验，利用Design-Expert 7.0.0软件进行分析。Box-Behnken试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.4 欧李仁油理化性质分析

水分及挥发物含量的测定：参照GB/T 5528—2008《动植物油脂：水分及挥发物含量测定》[14]方法；酸值的测定：参照GB/T 5530—2005《动植物油脂：酸值和酸度测定》[15]方法；碘值的测定：参照GB/T 5532—2008《动植物油脂：碘值的测定》[16]方法；皂化值的测定：参照GB/T 5534—2008《动植物油脂：皂化值的测定》[17]方法；磷脂含量的测定：参照GB/T 5537—2008《粮油检验：磷脂含量的测定》[18]方法。

1.3.5 脂肪酸成分分析

将得到的欧李仁油经过脱胶、脱酸、脱色等进行精炼[19-21]，精炼后的欧李仁油，用气相色谱仪，参照GB/T 17376—2008《动植物油脂：脂肪酸甲酯制备》[22]、GB/T 17377—2008《动植物油脂：脂肪酸甲酯的气相色谱分析》[23]进行脂肪酸成分分析。

1.3.6 抗氧化能力的测定[24]。

1.3.6.1 羟自由基清除率测定

用无水乙醇配制质量浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的欧李仁油溶液，取10 mL离心管，依次加入2 mL不同质量浓度的样品溶液、8.0 mmol/L的FeSO4溶液0.6 mL、20 mmol/L的H2O2溶液0.5 mL、3.0 mmol/L的水杨酸溶液2.0 mL；将离心管于37 ℃反应30 min，流水冷却，在2 000 r/min条件下离心10 min；取上清液于510 nm波长处，以乙醇调零比色得A1值，以乙醇代替20 mmol/L H2O2溶液测定A2值，以乙醇代替样品溶液测定A0值。平行测定3 次，其清除率计算见公式（2）：

式中：A0为未加清除剂的吸光度；A1为加入清除剂的吸光度；A2为试剂空白的吸光度。

1.3.6.2 超氧阴离子自由基清除率测定

用无水乙醇配制质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的欧李仁油溶液备用；取50 mmol/L、pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL（其中含有2 mmol/L的乙二胺四乙酸钠），加入0.1 mL不同质量浓度样液，在25 ℃条件下保温10 min，再加入25 ℃预热过的5 mmol/L邻苯三酚溶液0.2 mL，混合后迅速置于干燥比色皿中，3 min内在320 nm波长处每隔0.5 min测一次溶液吸光度，以10 mmol/L的HCl溶液调零，对照组以等体积乙醇代替样品。做吸光度随时间变化曲线，斜率为邻苯三酚的自氧化速率。样品对超氧阴离子自由基的清除率计算见式（3）：

式中：A对照为对照组吸光度；A样品为样品组吸光度。

2 结果与分析

2.1 欧李仁油提取单因素试验结果

2.1.1 液料比对欧李仁油提取率的影响

在提取温度60 ℃、提取时间4 h的条件下，分别选择液料比为8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1，探讨液料比对欧李仁油提取率的影响，结果见图1。

图1 液料比对欧李仁油提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of oil

从图1可知，随着液料比的升高，欧李仁油的提取率先显著增加后略有下降，这主要是由于石油醚用量的增加，使得石油醚与种仁充分接触，油脂从种仁向液体中的转移速率加快，从而使油脂的提取率增高。但是在液料比达到10∶1之后，液料比的增加反而使提取率下降，这种情况的原因是在该温度条件下提取剂的增加使得回收溶剂时间延长，增加了油脂在回收过程中的损失；同时，由于欧李仁中的油脂已大部分被提取出来，增加溶剂的用量，提取率变化不大。另外，从经济和环境的角度，初步确定最佳液料比为10∶1。

2.1.2 提取温度对欧李仁油提取率的影响

在提取时间2 h、液料比10∶1的条件下，分别选择提取温度为55、60、65、70、75、80 ℃，探讨提取温度对欧李仁油提取率的影响，结果见图2。

图2 提取温度对欧李仁油提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of oil

从图2可知，在55～60 ℃范围内，欧李仁油的提取率随着温度升高而显著增加；但在60～80 ℃范围内，随着提取温度的升高，欧李仁油的提取率反而下降。这主要是因为在提取初期，升高温度可以加速溶剂与油脂分子之间的扩散作用，但当提取温度升高到60 ℃之后，由于溶剂气化，溶剂与欧李仁粉不能充分接触，使得欧李仁油的提取率下降。并且，随着温度升高，易发生脂肪酸的氧化作用，使得油脂的提取率在75 ℃之后会有小幅度的回升。因此，选择60 ℃为欧李仁油的最佳提取温度。

2.1.3 提取时间对欧李仁油提取率的影响

在提取温度60 ℃、液料比10∶1的条件下，分别选择提取时间为2、3、4、5、6 h，探讨提取时间对欧李仁油提取率的影响，结果见图3。

图3 提取时间对欧李仁油提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of oil

从图3可知，随着提取时间的延长，欧李仁油提取率显著增加；但是5 h后随着时间的继续延长，欧李仁油提取率的上升速度减慢。这是由于在欧李仁油提取初期，欧李仁粉中的油脂含量高，固液间的质量浓度差大，扩散驱动力也较大，大量的油脂扩散到溶剂中，使得提取率不断升高；但当提取时间超过5 h时，由于欧李仁粉中的大量油脂已被提取出来，使得固液间的质量浓度差变小，在延长提取时间的情况下，欧李仁油提取率渐趋平缓。因此，选提取时间以4 h为宜。

2.2 响应面试验优化结果

2.2.1 模型的建立及试验结果

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计法对欧李仁油的提取工艺进行三因素三水平优化设计[25-26]。该模型的试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计方案及结果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型的显著性检验

根据表2结果，采用Design-Expert 7.0.0软件得欧李仁油提取率（Y）对液料比（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）的二次多项式回归方程：

Y=82.01+2.29X1—1.36X2+1.89X3+2.45X1X2—2.08XX—2.14XX—0.55X2—6.05X2—0.56X21323123

对响应面模型进行方差分析，结果见表3，模型系数显著性检验结果见表4。

表3 响应面模型的方差分析Table3 Variance analysis for response surface model

表4 回归模型系数显著性检验Table4 Significance test for each coefficient of regression model

由表3方差分析结果可知，实验所选模型F=7.68，表明该模型显著；模型P=0.006 8，表明该模型对实验的干扰仅为0.68%。失拟项P=0.063 7＞0.05，不显著。其中，P＜0.050 0时，该模型项显著。因此，模型的一次项X1、X3对欧李仁油提取的线性效应显著；二次项X22对欧李仁油提取的曲面效应显著。结合表4可得出，影响欧李仁油提取率的主次因素依次为X1＞X3＞X2，即液料比＞提取时间＞提取温度。

2.2.3 响应面分析

根据回归模型作出相应的响应面和等高线图，考察拟合响应面的形状，分析各因素对欧李仁油提取率的影响，结果见图4。

由图4a可知，提取时间为4 h时，随着液料比的升高，在低温度范围内，欧李仁油的提取率随着提取温度的升高而不断增大，但在高温度条件下，欧李仁油提取率随着液料比的增大而呈下降趋势。由图4b可知，提取温度为60 ℃时，随着液料比的增大，欧李仁油提取率随着时间的延长呈上升趋势。当提取时间延长，液料比增大时，欧李仁油提取率达最大。由图4c可知，液料比为10∶1，随着提取温度的不断升高，欧李仁油的提取率在该时间范围内先升高后降低。

图4 各因素相互作用的响应面及等高线图Fig.4 Response surface and contour maps for the effects of extraction parameters and their interactions on the extraction rate of oil

利用Design-Expert 7.0.0软件结合回归模型，欧李仁油的最佳提取工艺参数为液料比9.18∶1、提取温度57.7 ℃、提取时间5 h，欧李仁油的理论提取率可达84.053%。对优化参数进行3 次重复验证，得欧李仁油的提取率为84.57%，与理论值没有显著性差异，进一步验证了回归模型的合理性。

2.3 欧李仁油的理化性质

表5 欧李仁油的理化性质Table 5 Physicochemical properties of seed oil extracted from Chinese dwarf cherry rry

由表5可知，欧李仁油的磷脂含量为0.10 mg/g，磷脂含量不高，油脂性质稳定；精炼欧李仁油碘值为108 g/100 g，说明欧李仁油中含有一定量的不饱和脂肪酸；精炼后油脂的酸值为1.62 mg KOH/g，说明该油中含有少量的游离脂肪酸；皂化值为185.2 mg KOH/g。

2.4 脂肪酸组成

由表6可知，欧李仁油由11 种脂肪酸组成，主要是不饱和脂肪酸，含量为94.42%，其中包括油酸、亚油酸、棕榈油酸、顺-11-二十碳一烯酸、α-亚麻酸。油酸和亚油酸是主要的不饱和脂肪酸，其含量分别为63.0%和30.7%。这与野生欧李仁油[27]的主要脂肪酸含量基本一致。

表6 精炼欧李仁油的脂肪酸组成Table 6 Comparison of fatty acids in refined seed oil from cultivated and wild Chinese dwarf cherry y

2.5 精炼欧李仁油的总抗氧化活性

图5 欧李仁油对羟自由基的清除率Fig.5 Hydroxyl radical scavenging rate of seed oil from Chinese dwarf cherry

2.5.1 欧李仁油对羟自由基的清除能力由图5可知，在用无水乙醇配制的0.1～0.7 mg/mL质量浓度内，欧李仁油对羟自由基清除率随着质量浓度的增加而增大。当油脂质量浓度为0.7 mg/mL，欧李仁油对羟自由基的清除率为90.28%。

2.5.2 欧李仁油对超氧阴离子自由基的清除能力

图6 欧李仁油对超氧阴离子自由基的清除率Fig.6 Superoxide anion radical scavenging rate of seed oil from Chinese dwarf cherry

由图6可知，在用无水乙醇配制的0.2～1.2 mg/mL范围内，随着样液质量浓度的增加，欧李仁油对超氧阴离子自由基的清除率也随着增大。当欧李仁油的质量浓度为1.2 mg/mL时，欧李仁油对超氧阴离子自由基的清除率为92.60%。

3 结 论

在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken设计、响应面优化及Design-Expert 7.0.0软件分析，以欧李仁油提取率为指标，以液料比、提取温度、提取时间为考察因素，建立模型。根据模型及试验结果，确定了欧李仁油的最佳提取工艺参数为液料比9.18∶1、提取时间5 h、提取温度57.7 ℃，此条件下欧李仁油的提取率为84.57%。欧李仁油的水分及挥发物含量为0.03%，磷脂含量为0.10 mg/g，精炼后酸值为1.62 mg KOH/g，碘值为108 g/100 g。精炼欧李仁油中含有大量的不饱和脂肪酸，其中最主要的是油酸和亚油酸，含量分别为63.0%和30.7%。精炼欧李仁油具有很好的抗氧化性质，油脂质量浓度为0.7 mg/mL时，对羟自由基的清除率为90.28%；精炼欧李仁油的质量浓度为1.2 mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率为92.60%。

[1] 王有信, 何卫军, 李向东, 等. 欧李种质资源分布及种群分类特性研究[J]. 山西果树, 2005(6): 36-38.

[2] 曹琴, 张玉娥, 岳文英. 欧李名与实研究[J]. 山西农业大学学报: 社会科学版, 2002, 1(3): 247-249.

[3] 刘保东, 孙井山, 杜鹃, 等. 西部特有野生树种欧李优良类型选择研究[J]. 内蒙古林业科技, 2008, 34(4): 33-48.

[4] CHAU C F, WU S H. The development of regulations of Chinese herbal medicines for both medicinal and food uses[J]. Trends in Food Science and Technology, 2006, 17(6): 313-323.

[5] HALBERSTEIN R A. Medicinal plants: historical and cross-cultural usage patterns[J]. Annals of Epidemiology, 2005, 15(9): 686-699.

[6] 魏金婷, 刘文奇. 方药中苦杏仁苷的研究和应用进展[J]. 海南医学院学报, 2007, 13(6): 589-596.

[7] KWON H Y, HONG S P, HAHN D H, et al. Apoptosis induction of persicae semen extract in human promyelocytic leukemia (HL-60) cells[J]. Archives of Pharmacal Research, 2003, 26(2): 157-161.

[8] SHIN K M, PARK Y, KM I, et al. In vitro anti-inflammatory activity of bitte of amygdalin inmurune macrophage raw 2647 cells[J]. Korean Journal of Pharmacognosy, 2003, 34(3): 223-227.

[9] HWANG H J, LEE H J, KIM C J, et al. Inhibitory effect of amygdalin on lipopolysaccharide-inducible TNF-alpha and IL-lbeta mRNA expression and carrageenan-induced rat arthritis[J]. Journal of Microbiology Biotechnology, 2008, 18(10): 1641-1647.

[10] 张美莉, 邓秋才, 杨海霞, 等. 内蒙古欧李果肉和果仁中营养成分分析[J]. 氨基酸和生物资源, 2007(4): 18-20.

[11] 薛勇. 欧李仁成分分析及油脂的提取[D]. 郑州: 郑州工程学院, 2003: 3.

[12] 李卫东, 刘志国, 魏胜利, 等. 早熟欧李新品种‘京欧1号’[J]. 园艺学报, 2010, 37(4): 679-680.

[13] 卫生部食品卫生监督检验所. GB/T 5009. 6—2003 食品中脂肪的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.

[14] 中粮北海粮油工业(天津)有限公司. GB/T 5528—2008 动植物油脂:水分及挥发物含量测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[15] 国家粮食局西安油脂食品及饲料质量监督检验测试中心, 北京市粮油食品检验所. GB/T 5530—2005 动植物油脂: 酸值和酸度的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2005.

[16] 武汉工业大学. GB/T 5532—2008 动植物油脂: 碘值的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[17] 武汉工业大学, 国家粮食储备局武汉科学研究设计院. GB/T 5534—2008 动植物油脂: 皂化值的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[18] 中粮北海粮油工业(天津)有限公司. GB/T 5537—2008 粮油检验:磷脂含量的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[19] 王慧敏. 橡胶籽油的提取、精炼及其氧化稳定性研究[D]. 海口: 海南大学, 2012.

[20] 葛含静. 苹果籽油提取、理化性质测定及脂肪酸成分分析研究[D].西安: 陕西师范大学, 2006.

[21] 谢莹. 米糠油制取及精炼工艺的研究[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2013.

[22] 国家粮食储备局西安油脂科学研究设计院. GB/T 17376—2008 动植物油脂: 脂肪酸甲酯制备[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[23] 国家粮食储备局西安油脂科学研究设计院, 陕西省产品质量监督检验所, 中粮黄海粮油工业(山东)有限公司. GB/T 17377—2008动植物油脂: 脂肪酸甲酯的气相色谱分析[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[24] 林海. 欧李仁油抗氧化活性的研究[J]. 食品工业科技, 2012, 33(15): 105-111.

[25] 周丽卿, 杜双奎, 赵佳, 等. 响应面法优化鹰嘴豆蛋白提取工艺[J].食品科学, 2012, 33(8): 66-70.

[26] 陈燕勤, 陈德军, 杨再磊, 等. 基于响应面法优化文冠果种仁油的提取工艺研究[J]. 化学生物与工程, 2012(2): 33-36.

[27] 穆霄鹏, 杜俊杰, 杜俊民. 钙果仁油的提取及成分分析[J]. 食品科技, 2012, 37(12): 140-143.

Extraction, Fatty Acid Composition and Antioxidant Activity of Seed Kernel Oil from Cultivated Chinese Dwarf Cherry

GAO Youjun, REN Qing*
(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Bussiness University, Beijing 100048, China)

The purpose of the present study was to optimize seed oil extraction from Chinese dwarf cherry using combination of response surface methodology and single factor method. The optimal extraction parameters were found to be a solvent volume to seed kernel ratio of 9.18:1 (mL/g), 5 h extraction time and 57.7 ℃ extraction temperature, leading to an oil yield of 84.57%. The fatty acid composition of the refined oil was determined by gas chromatography. Eleven fatty acids were detected in the refined oil, including 63.0% oleic acid and 30.7% linoleic acid. The radical scavenging rates of the oil at concentrations of 0.7 and 1.2 mg/mL against hydroxyl and superoxide anion radicals were 90.28% and 92.60%, respectively.

seed kernel oil of Chinese dwarf cherry; extraction process; response surface methodology; fatty acids; antioxidant activity

TS222

A

1002-6630（2015）04-0080-06

10.7506/spkx1002-6630-201504015

2014-06-30

高友君（1987—），女，硕士研究生，主要从事天然活性成分的研究与开发。E-mail：youjun.5624@163.com

*通信作者：任清（1969—），男，副教授，博士，主要从事天然植物生物活性成分的研究和开发及构建高产香味物质的基因工程菌株研究。E-mail：renqing@th.btbu.edu.cn