有氧运动对慢性心力衰竭大鼠骨骼肌糖原和运动耐力的影响①

甄洁，朱荣

有氧运动对慢性心力衰竭大鼠骨骼肌糖原和运动耐力的影响①

甄洁1，朱荣2

目的观察8周有氧运动对慢性心力衰竭大鼠骨骼肌糖原含量和运动耐力的影响和可能机制。方法30只Sprague-Dawley大鼠分为心力衰竭安静组(H组，n=10)、心力衰竭运动组(HT组，n=10)和假手术组(S组，n=10)，采用冠状动脉结扎术复制心力衰竭模型。HE组进行8周跑台训练。干预后用蒽酮法测定骨骼肌糖原含量，递增负荷力竭运动试验测定力竭时间，放射性同位素法测定葡萄糖摄取率、骨骼肌糖原合酶(GS)和糖原磷酸化酶(GP)活性，Western Blotting法测定总GS、磷酸化GS (p-GS)、总GP以及磷酸化GP(p-GP)蛋白表达；对糖原含量和力竭时间进行相关分析。结果与S组大鼠比较，H组骨骼肌糖原含量、力竭时间、胰岛素介导的葡萄糖摄取率、GS活性和p-GP蛋白表达量降低(P＜0.05)，血清胰岛素、GP活性和p-GS蛋白表达量升高(P＜0.05)；与H组比较，HT组骨骼肌糖原含量、力竭时间、胰岛素介导的葡萄糖摄取率、GS活性和p-GP蛋白表达量增加(P＜0.05)，血清胰岛素、GP活性和p-GS蛋白表达量降低(P＜0.05)。糖原含量和力竭时间显著正相关(P＜0.05)。结论长期有氧运动能提高慢性心力衰竭大鼠骨骼肌糖原含量和运动耐力，可能与胰岛素敏感性改善，葡萄糖摄取增加，糖原合成增多、分解减少有关。

心力衰竭；有氧运动；骨骼肌；糖原；运动耐力；大鼠

[本文著录格式]甄洁，朱荣.有氧运动对慢性心力衰竭大鼠骨骼肌糖原和运动耐力的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21 (4):426-431.

CITED AS:Zhen J,Zhu R.Effects of aerobic exercise on skeletal muscle glycogen and exercise endurance in rats with chronic heart failure[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):426-431.

心力衰竭患者除心脏本身病变外，典型的症状是对运动不耐受，易疲劳，是影响心力衰竭患者生活质量的主要因素[1-2]。心力衰竭治疗的硬终点(hard endpoints)是改善患者的运动能力和生活质量[3]。心力衰竭时，机体分解代谢加强，糖代谢供能比增加，使得肌糖原含量减少。骨骼肌糖原含量降低是心力衰竭患者运动耐力下降的重要原因，减少骨骼肌糖原利用、增加肌糖原含量可显著提高心力衰竭患者的运动能力并改善生活质量[4]。康复运动，特别是有氧运动，是有效治疗心力衰竭的非药物疗法[5-6]。本研究观察8周有氧运动对心力衰竭大鼠运动耐力的影响，探讨糖原代谢在心力衰竭运动康复中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠30只，体重250～300 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物生产许可证批号SCXK-(军)2007-004，动物批号0006645，动物使用许可证批号SYXK(京) 2008-0009。自由进食水。本实验在北京体育大学科研中心和中国农业科学院生物技术研究所作物功能基因与遗传改良研究室完成。

将动物分为心力衰竭安静组(H组，n=10)，心力衰竭运动组(HT组，n=10)和假手术组(S组，n=10)。

1.2 造模

大鼠戊巴比妥钠0.1 mg/kg腹腔麻醉后胸部备皮，连接小动物呼吸机。在心尖搏动处开胸暴露心脏，0号丝线结扎冠状动脉前降支，心电图示心肌缺血性改变(Ⅱ导联出现ST段弓背向上抬高)持续30 min标志手术成功。缝合胸壁。术后连续给予青霉素105U肌注3 d。S组开胸后只穿针，不结扎冠状动脉，其余处理同上。

1.3 干预方法

S组和H组动物在鼠笼内自由活动。HT组术后4周开始跑台适应性训练，速度10～15 m/min，每天30 min，共5 d。之后开始正式训练，速度16 m/min(最大摄氧量的50%～60%)，坡度0°，每天60 min，每周5 d，共8周。

1.4 评定方法

1.4.1 运动耐力测定

各组大鼠在末次训练后第2天进行递增负荷运动实验。5 m/min跑台10 min热身后，起始负荷10 m/min，3 min递增5 m/min，直到力竭。力竭判定标准：动物跟不上预定速度，大鼠臀部压在笼具后壁，后肢随转动皮带后拖达30 s，毛刷刺激驱赶无效，行为特征为呼吸深急、幅度大，精神疲倦，俯卧位垂头，刺激后无反应。记录力竭时间。

1.4.2 心脏超声检测

同前腹腔麻醉大鼠，胸部备皮，仰卧位固定。用Vevo 770小动物超声影像诊断系统(VISUALSONICS公司)进行心脏超声检查。探头频率7.0 MHz，置于左胸获取M型超声心动图，测量左心室短轴缩短分数(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室收缩末期直径(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左心室舒张末期直径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)和心率(heart rate,HR)。每组原始数据取连续3个心动周期的平均值。

1.4.3 动物取材

运动耐力测定后48 h称体重，尾静脉取血300 μl，4℃3000 r/min离心后取血清。迅速取出心脏，洗净并剔除非心肌组织，称量心脏重量(heart weight, HW)后分离左心室，滤纸吸干，称量左室重量(left ventricular weight,LVW)，计算其与体重比值，分别计为心脏重量指数(heart weight index,HWI)和左室心脏重量指数(left ventricular weight index,LVWI)。

取左侧肺叶称湿重，置真空干燥箱24 h后称干重，计算肺含水率(lung water ratio,LWR)。

分离股四头肌，锡纸包裹，投入液氮中，移至-80℃冰箱冻存待测。

1.4.3.1 血糖和血胰岛素测定

氧化酶法测定血糖浓度。试剂盒购自南京建成生物有限公司，检测仪器为MD-100半自动生化分析仪。放免法测定血清胰岛素含量，试剂盒购自武汉博士德生物公司，检测仪器为FMQ-9013C型γ放免仪。严格按照操作说明书进行。

1.4.3.2 肌糖原含量测定

采用蒽酮法测定，测试仪器为722型光栅分光光度计。取骨骼肌50 mg，加3倍体积浓碱溶液，沸水浴20 min；冷却后用双蒸水稀释20倍。取100 μl溶液加水至1 ml，加入2 ml蒽酮显色剂，震荡混匀，沸水浴5 min；冷却后以空白管调零，测定各样品和葡萄糖标准溶液在620 nm处的吸光度，计算糖原含量。

1.4.3.3 葡萄糖摄取率测定

取骨骼肌100 mg，分别加入到不含胰岛素(Ins-)或含胰岛素(Ins+)的1.0 μmol/L Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液中。在37℃、95%O2、5%CO2条件下震荡孵育1 h，加入1.5 nmol/L 2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)和0.5 μCi3H-2-DG，继续孵育30 min。洗涤肌肉组织后转移至液闪瓶中，加入过氯酸和双氧水，80℃消化3～4 h，室温冷却。加乙二醇乙醚和闪烁液，暗室放置12 h。用全自动液闪仪(Beckman LS 3801)测定其放射性。

1.4.3.4 糖原合酶(glycogen synthase,GS)活性测定

取骨骼肌50 mg匀浆后，加入GS提取液中，4℃、14000 g离心30 min，取上清。取上清液50 μl加入等体积含0.1 mCi/mmol14C-尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)的酶测定缓冲液，活化型GS测定介质不含葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate,G6P)(G6P-)，GS总酶测定介质含10 mmol/L G6P(G6P+)。用液体闪烁计数仪(Beckman LS 3801)测定放射性活性。GS活性用活化型酶活性与总酶活性的比值表示(G6P-/G6P+)。

1.4.3.5 糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,GP)活性测定

取骨骼肌50 mg，置于预冷的蛋白酶提取缓冲液0.5 ml中充分匀浆，4℃、14000 g离心30 min取上清。取上清液50 μL，加等体积含2.5 mCi/mol14C-葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-phosphate,G1P)的酶测定缓冲液，活化型GP测定介质不含AMP(AMP-)，GP总酶测定介质含6 mmol/LAMP(AMP+)。用液体闪烁计数仪(Beckman LS 3801)测定放射活性。GP活性用活化型酶活性与总酶活性的比值表示(AMP-/AMP+)。

1.4.3.6 GS和GP的蛋白表达测定

取骨骼肌100 mg匀浆裂解后，4℃、15000 g离心20 min，用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。取蛋白样品10 μg在垂直电泳仪(BIO-RAD)上经15%基质钠十二烷基硫酸聚丙烯胺凝胶电泳(substrate-sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis, SDS-PAGE)分离后，转移至PVDF膜上。兔抗鼠GP、磷酸化GP(p-GP)、GS、磷酸化GS(p-GS)4℃静置孵育过夜，洗涤3次。再以1∶1000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h；充分洗涤，使用ECL试剂盒发光显影，X线胶片压片曝光，扫描定量各条带的相对灰度值，以β-actin为内参蛋白。

1.5 统计学分析

采用SPSS 15.0 for Windows统计软件处理。所有数据以(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)，多重比较使用Bonferroni检验。对糖原含量和力竭时间进行Pearson相关分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 体重与心脏指数

与S组比较，H组HW、HWI、LVW、LVWI和LWR升高(P＜0.05)；与H组比较，HT组LWR降低(P＜0.05)。见表1。

2.2 心脏结构与功能

与S组比较，H组LVESD和LVEDD升高(P＜0.05)，LVFS和LVEF降低(P＜0.05)；与H组比较，HT组LVESD和LVEDD降低(P＜0.05)，LVFS和LVEF升高(P＜0.05)。见表2。

表1 各组大鼠体重与心脏指数的变化

2.3 力竭时间与糖代谢

与S组比较，H组力竭时间降低，血胰岛素升高，肌糖原降低(P＜0.05)；与H组比较，HT组力竭时间升高，血胰岛素降低，肌糖原升高(P＜0.05)。见表3。

相关分析显示，各组肌糖原水平均与力竭时间正相关(S组r=0.57，P＜0.05；H组r=0.71，P＜0.05；HT组r=0.60，P＜0.05)。

基础葡萄糖摄取率(Ins-)三组间无显著性差异(P＞0.05)，但胰岛素介导的葡萄糖摄取率(Ins+)H组低于S组(P＜0.05)，HT组高于H组(P＜0.05)。见表3。

2.4 酶活性和蛋白表达

与S组比较，H组活化型GS活性和活性GS比值降低，p-GS蛋白表达升高(P＜0.05)；活化型GP活性和活性GP比值升高，p-GP蛋白表达降低(P＜0.05)。与H组比较，HT组活性GS比值升高，p-GS蛋白表达降低(P＜0.05)；GP活性和活性GP比值降低，p-GP蛋白表达升高(P＜0.05)。。GS总蛋白、GS总酶活性、GP总蛋白和GP总酶活性三组间无显著性差异(P＞0.05)。见表4，图1、图2。

表2 心脏结构与功能的变化

表3 两组力竭时间与糖代谢比较

表4 各组酶活性比较

图1 各组GS和p-GS蛋白比较

图2 各组GP和p-GP蛋白比较

3 讨论

本研究成功建立心梗后慢性心力衰竭模型，心脏发生重塑，表现为左室肥厚、心腔代偿性扩张、肺水肿以及心搏出功能下降。

运动康复是治疗慢性心力衰竭的有效手段。随机对照临床实验与Meta分析均显示[5,7]，长期规律有氧运动可延缓心力衰竭患者心功能的下降，提高运动耐力，减轻疲劳与呼吸困难等症状，在一定程度上改善心力衰竭患者的生活质量，降低住院率与死亡率。本研究显示，有氧运动有助于抑制心脏重塑，提高心功能。

糖原是运动中的重要能源物质，其储备量与运动能力密切相关[8]。心力衰竭时，机体能源物质不足，骨骼肌灌注减少，缺血缺氧使骨骼肌的供能方式由利用自由脂肪酸转向糖酵解，脂质沉积，细胞酸中毒，糖原利用增加[9-12]。我们前期的研究证实，8周有氧跑台运动可增加心肌脂肪酸利用，减轻心脏脂质过度沉积，改善脂毒性心脏异常[13]。

骨骼肌糖原含量降低是心力衰竭患者易疲劳和运动不耐受的重要原因。上调骨骼肌糖原含量或减缓糖原利用均可改善心力衰竭患者对运动的不耐受，加快心力衰竭康复，进而提高生活质量[4]。长期有氧运动可提高正常骨骼肌糖原含量[14]。本研究显示，有氧运动使心力衰竭大鼠骨骼肌糖原含量升高，同时力竭时间增加，且两者显著正相关，说明有氧运动通过增加骨骼肌糖原含量改善运动耐力。

糖原含量是由骨骼肌摄取葡萄糖、糖原合成以及糖原分解等因素共同决定。肌糖原的合成与肌细胞摄取葡萄糖的速率成正比，正常骨骼肌在糖原不足时，可通过摄取血糖作为能源底物供能[15]。本研究显示，H组血清胰岛素升高而胰岛素介导的葡萄糖摄取率降低，说明心力衰竭时存在明显的胰岛素抵抗，骨骼肌对血糖的利用减少；而长期有氧运动提高了胰岛素敏感性，骨骼肌摄取血糖的能力增强。

胰岛素抵抗主要是由于骨骼肌葡萄糖跨膜转运体葡萄糖转运体4(glucose transporter type 4,GLUT4)表达下调，以及从胞浆向细胞膜转位减少[16]；研究证实，运动可通过上调AMP活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)并促进GLUT4表达上调与转位[17]，可能是运动改善胰岛素抵抗的机制之一。

GS和GP分别是糖原合成与分解的关键酶。GS磷酸化失活，去磷酸化后激活，GP则相反[18]。此外，无活性的GS还受G6P的别构调节而被激活[19]。本研究显示，心力衰竭后GS活性和p-GP蛋白表达量增加，GP活性和p-GS蛋白表达量降低，提示心力衰竭时糖原合成减少、利用增加；长期有氧运动可促进糖原合成并降低其分解。

有研究显示，糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK-3)通过磷酸化GS使其失活，从而阻止糖原合成[20]。心力衰竭时，心肌GSK-3表达下调[21]，而在发生胰岛素抵抗(如糖尿病)的骨骼肌中表达上调[22]；有氧运动可下调骨骼肌GSK-3表达，从而促进糖原合成[22]。转基因实验证实，将突变型GS基因敲入小鼠体内(GS不能被G6P变构激活，但可通过去磷酸化共价修饰而活化)，胰岛素诱导的肌糖原合成速

率减少80%，糖原含量显著下降，说明胰岛素调控肌糖原合成主要通过对GS的变构激活实现的[23]。运动上调心力衰竭大鼠GS活性的机制(共价修饰调节和/或变构调节)尚无定论。

此外，心力衰竭时，儿茶酚胺等应激激素升高使糖原分解加速[24]，有氧运动可抑制交感系统活性[25]，降低儿茶酚胺浓度[26]，抑制糖原分解，可能也是糖原含量增加的原因之一。

综上所述，心力衰竭时由于胰岛素抵抗、骨骼肌摄取葡萄糖减少、糖原合酶活性下降以及糖原磷酸化酶活性增高，造成骨骼肌糖原含量降低、运动耐力下降。长期有氧运动提高了心力衰竭大鼠骨骼肌糖原含量和运动耐力，其机制可能与胰岛素敏感性改善，葡萄糖摄取增加，糖原合成增多、分解减少有关。

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Effects of Aerobic Exercise on Skeletal Muscle Glycogen and Exercise Endurance in Rats with Chronic Heart Failure

ZHEN Jie1,ZHU Rong2
1.the Physical Education Department of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450001,China;2.Wenzhou Medical University,Wenzhou,Zhejiang 325035,China

Objective To observe the effects of 8-week aerobic exercise on skeletal muscle glycogen content and exercise endurance and investigate the possible mechanism in rats with chronic heart failure.Methods 30 Sprague-Dawley rats were submitted to heart failure sedentary(H)group,heart failure traning(HT)group and sham operation(S)group.The heart failure model was established with coronary artery ligation.HT group performed an 8-week treadmill running.The skeletal muscle glycogen content was determined with anthracenone, exercise endurance with exhaust duration of graded exhausted exercise test,glucose uptake rate,activity of glycogen synthase(GS)and glycogen phosphorylase(GP)with radicisotope,protein expression of total GS,phospho-GS(p-GS),total GP and phospho-GP(p-GP)with Western Blotting.Correlation analysis was conducted between glycogen content and exhaust duration.Results The skeletal muscle glycogen,exhaust duration,glucose uptake rate,GS activity and p-GP protein reduced(P＜0.05),while serum insulin,GP activity and p-GS protein raised(P＜0.05)in the H group compared with those in the S group.The skeletal muscle glycogen,exhaust duration,glucose uptake rate,GS activity and p-GP protein increased(P＜0.05),while serum insulin,GP activity and p-GS protein decreased(P＜0.05)in the HT group compared with those in the H group.There was positive correlation between glycogen content and exhaust duration(P＜0.05).Conclusion Prolonged aerobic exercise enhanced skeletal muscle glycogen content and exercise endurance in rats with chronic heart failure,which may be related to the improvement of insulin sensitivity,muscle glucose uptake,increase of glycogen synthesis and decrease of glycogen breakdown.

heart failure;aerobic exercise;skeletal muscle;glycogen;exercise endurance;rat

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.013

R541.6

A

1006-9771(2015)04-0426-06

2014-12-13

2015-01-29)

浙江省科学技术厅公益性技术应用研究计划项目(No.2014C33262)。

1.郑州大学体育系，河南郑州市450001；2.温州医科大学，浙江温州市325035。作者简介：甄洁(1973-)，女，汉族，河北新乐市人，硕士，讲师，主要研究方向：运动医学。通讯作者：朱荣(1971-)，女，汉族，四川成都市人，副教授，博士，主要研究方向：运动与骨骼肌代谢。E-mail:zhurong9191@sina.com。