自由基清除剂预防创伤性异位骨化的实验研究①

闵红巍，刘克敏，顾蕊，徐峰，韩新祚，亓攀

自由基清除剂预防创伤性异位骨化的实验研究①

闵红巍，刘克敏，顾蕊，徐峰，韩新祚，亓攀

目的比较口服非甾体类抗炎药物(NSAIDs)和静脉应用自由基清除剂对创伤性异位骨化动物模型的疗效。方法48只新西兰白兔随机分成对照组、NSAIDs组、自由基清除剂组和联合治疗组，每组各12只。建立创伤性异位骨化模型，NSAIDs组、自由基清除剂组和联合治疗组分别予口服吲哚美辛、静脉注射依达拉奉以及联合应用两药，对照组予生理盐水，共用药4周。分别于术后8周、12周行X线检查，观察各组异位骨化的发生率和严重程度。结果术后8周、12周，NSAIDs组异位骨化发生率为33.3%和41.7%，自由基清除剂组异位骨化发生率为43%和45.8%，联合治疗组异位骨化的发生率为29.2%和37.5%，对照组异位骨化的发生率为70.8%和75%。各治疗组异位骨化的发生率和严重程度均低于对照组(P＜0.05)，而各治疗组之间异位骨化的发生率和严重程度无显著性差异(P＞0.05)。结论全身应用自由基清除剂可有效地预防异位骨化形成，其效果与NSAIDs相当。两者不存在协同作用。

创伤性异位骨化；自由基清除剂；预防；兔

[本文著录格式]闵红巍，刘克敏，顾蕊，等.自由基清除剂预防创伤性异位骨化的实验研究[J].中国康复理论与实践,2015, 21(4):422-425.

CITED AS:Min HW,Liu KM,Gu R,et al.Effect of free radical scavenger on prevention of traumatic heterotopic ossification in rabbits[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):422-425.

异位骨化是指在没有骨组织的部位出现板层骨结构，是骨科常见的并发症。它不仅能使受累的关节活动受限，增加并发症(压疮、泌尿系感染、血管神经卡压等)出现的风险，还能使原有疾病的症状加重，严重影响患者的生活质量。目前，创伤性异位骨化的发病机制尚不清楚，因此找到有效的防治方法非常困难。传统的防治方法，如非甾体类抗炎药物(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、放射治疗等，都有其局限性[1]。本研究探讨全身应用自由基清除剂的疗效，并与传统的NSAIDs进行比较。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

雄性新西兰白兔48只，由首都医科大学动物中心提供，体重(2.5±0.5)kg，年龄4～5个月。采用随机数字表将动物分为NSAIDs组、自由基清除剂组、联合治疗组和对照组，每组12只。普通环境常规饲养。

1.2 造模方法

家兔俯卧位固定于手术台，双侧髋关节备皮。5%戊巴比妥钠0.5 ml/kg静脉注射麻醉。以大转子为中心，做长约4 cm直切口，切开皮肤、皮下和深筋膜，分离臀大肌，部分剥离大转子部肌肉止点；在大转子尖骨面用直径2.5 mm钻头钻通髓腔，至髓腔内容物流出。止血钳钳夹臀中肌3 min，造成局部组织缺氧。逐层缝合深筋膜、皮下和皮肤。

1.3 干预方法

NSAIDs组于造模后第1天予吲哚美辛口服，起始剂量10 mg/kg，每天1次；2周后减至5 mg/kg。吲哚美辛胶囊(张家口市东风制药厂，批号200301001)内粉末混于生理盐水，摇匀后制成合适浓度悬浮液。注射器抽取合适剂量后，通过硬饲喂管注入家兔食道。

自由基清除剂组于造模后第1天予依达拉奉(吉林辉南长龙生化药业股份有限公司，批号20120407)20 mg加入适量生理盐静脉滴注，每天1次。

联合治疗组同时给予吲哚美辛和依达拉奉，方法同前。对照组予口服生理盐水。4组动物均用药4周。

1.4 观测指标

1.4.1 一般情况

术后未应用抗生素和镇痛药物，笼内自由放养，密切观察动物一般情况、伤口愈合和双后肢活动。

1.4.2 影像学观察

各组动物分别于术后8周、12周行双侧髋关节正位X线摄片，观察是否有异位骨化发生、异位骨化的部位和范围。

异位骨化评价按Delee分型[2]。0级：无异位骨化形成；Ⅰ级：异位骨化范围未超过股骨与骨盆距离的50%；Ⅱ级：异位骨化范围超过股骨与骨盆距离的50%，但未形成桥接；Ⅲ级：股骨与骨盆间形成骨桥，骨性强直。评级由两名医生共同完成。计算各组的平均分级。

平均分级=(0级例数×0+Ⅰ级例数×1+Ⅱ级例数× 2+Ⅲ级例数×3)/总例数

1.5 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行处理。各组异位骨化发生率比较采用χ2检验；各组异位骨化的严重程度(各分级例数和平均分级)比较采用非参数检验Kruskal-Wallis H法，两两比较采用Mann-Whitney U法。显著性水平α=0.05。

2 结果

48只家兔术后死亡3只，死亡时间为术后13～21 d。兔尸检见胃穿孔和胃黏膜糜烂溃疡。由动物实验中的冗余备份补充。

各组平均分级见图1。术后8周、12周，各治疗组异位骨化发生率和严重程度均低于对照组(P＜0.05)，各治疗组间异位骨化发生率和严重程度无显著性差异(P＞0.05)。见表1、表2、图2。

图1 术后8周和12周各组异位骨化的平均分级

表1 术后8周各组髋关节异位骨化发生情况比较(n)

表2 术后12周各组髋关节异位骨化发生情况比较(n)

图2 各组X线片示例

3 讨论

1883年，Riedel首次系统描述异位骨化这一现象。到目前为止，其发生机制仍不十分清楚。异位骨化可分为遗传性和继发性两大类。继发性异位骨化最常见于人工髋关节置换术后和骨盆骨折；遗传性异位骨化则常见于中轴骨，但也可以影响其他关节。异位骨化一旦形成，无法改变其自然病程[3]，只有手术切除才能根治，而术后复发率也较高。因此早期预防尤为重要。

目前，异位骨化防治的方法包括药物(双磷酸盐类、NSAIDs、秋水仙碱、维生素K抑制剂、脂多糖[4]、选择性视黄酸受体激动剂[5])、放射治疗[6]、物理治疗、脉冲电磁场、手术治疗、金属微粒[7]、基因治疗等。传统方法如NSAIDs和放射治疗副作用较大，而其他治疗方法，如金属微粒和基因治疗等还处于实验阶段，是否能应用于临床还需要进一步探索。

目前，继发性异位骨化的动物模型主要有6种。①植入物模型：植入诱导刺激物，如骨形态发生蛋白、骨髓干细胞、磷酸钙等。②髋部手术模型：1984年，Schneider介绍一个模仿人工髋关节置换术的动物模型[8]；2005年，Rumi成功地利用此模型进行放射治疗预防异位骨化最佳时间的研究，并且确认引起异位骨化的骨前体细胞的起源[9]。③制动-按摩模型：膝关节制动后强力被动活动。④直接创伤模型：如股四头肌钝性打击、爆炸性截肢模型[10]。⑤跟腱切断模型。⑥肌肉内注射刺激物，如乙醇。这些模型的可重复性和临床相关性不尽相同。髋部手术模型和爆炸性截肢模型是以发病机制为基础的动物模型，临床相关性较好。

本研究所采用的动物模型[11]是对髋部手术模型的改良。术中钻通髓腔，把髓腔内容物引入肌肉中；同时钳夹臀中肌，造成局部组织缺氧。同时获得成骨诱导物、具有成骨潜能的干细胞以及良好的组织环境3个要素，理论上认为此模型将获得较高的异位骨化发生率。此模型的优点是形成异位骨化的创伤机制与临床接近，因此有良好的临床指导意义。本组对照组术后12周时异位骨化发生率达75%，可以认为造模成功，适于异位骨化防治的研究。

NSAIDs是目前公认最有效的预防异位骨化形成的药物。临床常用的有吲哚美辛[12]、塞来西布[13]、萘普生等。其作用机制为抑制环氧化酶，阻止前列腺素E介导的炎症反应，并抑制间充质细胞向成骨细胞分化[14-15]。NSAIDs药物的副作用较大，包括胃肠道反应、出血、影响骨折愈合等。

异位骨化的发病机制十分复杂，目前认为可能与体液因素、神经免疫因素和局部因素有关。Gear等提出异位骨化形成必须具备3个条件：成骨前体细胞、成骨诱导因子、合适的组织环境[16]。Kaplan等提出影响异位骨化形成的一些因素：初始的刺激因素、损伤部分信号的传出、未定向分化的间充质干细胞和合适的局部组织坏境[17]。

创伤后异位骨化常发生于伤后2～4个月。本研究显示，对照组术后12周异位骨化的发生率高达75%，与文献报道的发病时间相符。NSAIDs组异位骨化的发生率和严重程度明显低于对照组，说明NSAIDs能预防异位骨化形成，与文献报道的结果一致[18]。术后8周和12周，自由基清除剂组异位骨化的发生率和严重程度均低于对照组，表明自由基清除剂也能预防异位骨化的发生。

自由基可改变细胞膜的通透性，促使兴奋性神经

递质释放，激活细胞膜蛋白酶和磷脂酶，导致局部组织坏死。局部坏死组织和低氧环境导致巨噬细胞聚集、释放肿瘤坏死因子、白细胞介素-1等炎症介质。这些炎症介质可刺激单核细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞内环氧化酶-2 mRNA的表达上调，导致前列腺素释放；炎症介质还可导致体内骨形态发生蛋白、催乳素、碱性成纤维细胞生长因子等的释放增加，这些因子参与骨重建过程，在异位骨化的发生中起重要作用[19]。自由基清除剂依达拉奉能降低羟自由基浓度，抑制脂质过氧化和花生四烯酸释放，从而降低前列腺素E、环氧化酶-2表达，改变异位骨化形成的局部环境因素和诱导因子浓度，从而预防异位骨化的形成。有文献报道，依达拉奉可下调骨形态发生蛋白-2和环氧化酶-2表达[20]，对预防异位骨化具有积极重要的意义。

异位骨化发生的病理生理过程可能存在缺氧状态，局部组织缺氧产生大量自由基。因此有学者将自由基的产生和异位骨化的发生过程联系在一起。Vanden等通过动物实验研究显示，自由基清除剂别嘌呤醇和乙酰半胱氨酸具有预防异位骨化的作用[21-22]，与本研究的结果一致。

本研究显示，3个治疗组之间，异位骨化的发病率和严重程度无显著性差异，说明NSAIDs和自由基清除剂之间无协同作用。

本研究的局限性：一方面样本量较少；另一方面观察的时间点比较少。要将自由基清除剂预防异位骨化应用于临床，尚需进一步明确自由基清除剂的最佳剂量，自由基清除剂的生物活性、在体内的持续时间及其最佳应用时间。尚有待进一步研究。

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Effect of Free Radical Scavenger on Prevention of Traumatic Heterotopic Ossification in Rabbits

MIN Hong-wei,LIU Ke-min,GU Rui,XU Feng,HAN Xin-zuo,QI Pan
1.School of Rehabilitation Medicine,Capital Medical University,Beijing 100068,China;2.Department of Orthopedics and Rehabilitation,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China

Objective To compare the effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs(NSAIDs)and free radical scavengers(FRS)on formation of traumatic heterotopic ossification(HO)in rabbits.Methods 48 New Zealand rabbits were randomly divided into control group (n=12),NSAIDs group(n=12),FRS group(n=12)and combination group(n=12).The model of traumatic HO was established,and the NSAIDs group,FRS group and combination group were administered indometacin intragastrically,edaravone intravenously and both,respectively,while the control group was administered normal saline for 4 weeks.The incidence and severity of HO were observed with X-ray 8 and 12 weeks after modeling.Results 8 and 12 weeks after operation,the incidence of HO was 33.3%and 41.7%in the NSAIDs group, 43.0%and 45.8%in the FRS group,29.2%and 37.5%in the combination group,and 70.8%and 75.0%in the control group,respectively. The incidence and severity of HO in all the treatment groups were significantly less than those in the control group(P＜0.05),and there was no significant difference among the treatment groups(P＞0.05).Conclusion The systemic application of FRS may prevent the formation of HO effectively,similar with the NSAIDs.There is no synergistic effect between them.

traumatic heterotopic ossification;free radical scavenger;prevention;rabbits

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.012

R68

A

1006-9771(2015)04-0422-04

2014-12-19

2015-01-12)

1.中国康复研究中心科研基金项目(No.2010-Q2)；2.北京丰台区卫生系统科学研究项目(No.2014-丰台)。

1.首都医科大学康复医学院，北京市100068；2.中国康复研究中心北京博爱医院骨科，北京市100068。作者简介：闵红巍(1971-)，男，汉族，黑龙江哈尔滨市人，博士，副主任医师，主要研究方向：骨关节康复。通讯作者：刘克敏。E-mail:keminlqliu@sina.com。