丁苯酞对SH-SY5Y细胞凋亡的影响①

赵素晨，吴庆文，程月发，陈娟，贾玉凤，孟奇

丁苯酞对SH-SY5Y细胞凋亡的影响①

赵素晨1，吴庆文1，程月发2，陈娟1，贾玉凤1，孟奇3

目的探讨丁苯酞对l-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法SH-SY5Y细胞加入1 µmol/L、10µmol/L、20µmol/L丁苯酞培养2 h，加入MPP+培养24 h。台盼蓝染色检测SH-SY5Y细胞存活率；罗丹明123染色检测线粒体膜电位的变化；ELISA检测胞浆P53的含量；Western blotting检测胞浆细胞色素C(CytC)、P53的表达。结果随丁苯酞剂量提高，SH-SY5Y细胞存活率提高(P＜0.05)，线粒体膜电位降低(P＜0.05)，P53和CytC蛋白表达下降(P＜0.05)。结论丁苯酞能够抵抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，其机制可能是通过抑制P53、CytC的表达，增加细胞线粒体膜稳定性。

帕金森病；丁苯酞；SH-SY5Y细胞；P53；细胞色素C；凋亡

[本文著录格式]赵素晨，吴庆文，程月发，等.丁苯酞对SH-SY5Y细胞凋亡的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(4): 412-416.

CITED AS:Zhao SC,Wu QW,Cheng YF,et al.Effect of butylphthalide on apoptosis of SH-SY5Y cells[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):412-416.

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种中枢神经系统变性疾病，发病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)，其主要的病理特征是黑质致密部多巴胺神经元的变性死亡和残存神经元胞浆内路易小体形成[1]。目前认为，细胞凋亡是多巴胺神经元细胞死亡的主要途径。细胞凋亡的具体机制不清，可能与线粒体功能障碍、ATP生成减少、氧化应激增强、自由基生成减少及α-突触核蛋白异常聚集有关[2]。研究表明，丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)可有效提高线粒体膜流动性，增加神经细胞线粒体ATP酶活性，稳

定线粒体膜和增加线粒体复合物Ⅳ的活性[3]，在体内外具有抑制细胞凋亡和神经保护的作用。其作用的某些靶点与帕金森病发病的病理途径相吻合，故推测丁苯酞在治疗帕金森病方面有重要意义。本研究用l-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导人体神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞建立帕金森病细胞模型，探讨丁苯酞对MPP+所致SH-SY5Y细胞线粒体损伤过程中P53和CytC蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SH-SY5Y细胞株购自中国科学院昆明细胞库。

丁苯酞：中国食品药品检定研究院国家药品标准物质，纯度99%)。MPP+：SIGMA公司。DMEM/ F12=1∶1培养基、胰酶、胎牛血清：GIBCO公司。GADPH抗体：华安生物技术有限公司。CytC、P53抗体：巴傲得生物科技有限公司。ELISA试剂盒：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。

YJ-1450超净工作台：中国苏州净化设备厂。CO2孵育箱：三洋公司。倒置相差显微镜、荧光显微镜：OLYMPUS公司。低温高速离心机：日立公司。ELX800uv酶标仪：Molecular Devices公司。凝胶成像系统：Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养与处理

将SH-SY5Y细胞株置于DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml)中，5%CO2孵育箱中37℃培养，2～3 d换培养基，倒置显微镜下观察细胞生长状态。待达到80%～90%细胞汇合后，按1∶2对细胞进行传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

对数期生长的SH-SY5Y细胞接种于24孔板中，接种密度为每孔(1～5)×105个，将细胞分为对照组、模型组、丁苯酞低剂量组、丁苯酞中剂量组、丁苯酞高剂量组，每组设置3个孔。待70%汇合后，对照组正常培养；模型组在培养基中加入MPP+1 mmol/L培养24 h；丁苯酞各剂量组分别向培养基中加入丁苯酞1 µmol/L、10µmol/L、20µmol/L培养2 h，再加入的MPP+1 mmol/L继续培养24 h。进行以下检测。

1.3 细胞存活率

收集细胞，细胞悬液0.9 ml中加入0.4%台盼蓝染液0.1 ml，混匀。3 min内于倒置显微镜下计数。死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染。每组细胞选取5个视野计数200个细胞，计算细胞存活率。重复3次。

细胞存活率(%)=存活细胞数/细胞总数×100%

1.4 线粒体膜电位检测

细胞弃去培养液，PBS洗3次，加0.1µg/ml罗丹明123染液避光孵育15 min。PBS冲洗后，荧光显微镜下观察摄片。随机选3个视野，Image J软件分析图片的平均荧光强度。

1.5 ELISA检测

每孔加入裂解液60 μl，重悬沉淀，冰上裂解15 min。ELISA试剂盒检测P53含量。重复3次。

1.6 Western blotting检测

提取胞浆蛋白。BCA试剂盒检测样品浓度进行蛋白定量。蛋白变性，SDS-PAGE电泳，湿转转膜，5%牛奶封闭1 h，分别加CytC单克隆抗体(1∶500)、P53单克隆抗体(1∶500)孵育，4℃摇床过夜；TBST洗3次，每次5 min；加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(二抗，1∶3000)，37℃孵育1 h；TBST洗3次，ECL显色。Image J软件分析条带灰度值，用内参GAPDH校准，计算蛋白相对表达含量。重复3次。

1.7 统计学分析

数据录入Excel表格，用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料用(±s)表示，采用单因素方差分析。显著性水平α1=0.05，非常显著性水平α2=0.01。

2 结果

2.1 细胞存活率

与对照组比较，模型组细胞存活率降低(P＜0.05)，丁苯酞低、中、高剂量组的细胞存活率均高于模型组(P＜0.05)；随丁苯酞浓度增高，细胞存活率也有增高的趋势。见表1。

2.2 线粒体膜电位

与对照组比较，模型组平均荧光强度升高(P＜0.05)，丁苯酞低、中、高剂量组平均荧光强度较模型组降低(P＜0.05)。见图1、表1。

2.3 ELISA检测

与对照组比较，模型组P53含量增加(P＜0.05)，丁苯酞低、中、高剂量组P53含量均较模型组减少(P＜0.05)。见表1。

2.4 Western blotting检测

与对照组比较，模型组Cyt-C、P53蛋白表达均升高(P＜0.05)，丁苯酞低、中、高剂量组蛋白表达量较模型组降低(P＜0.05)。见图2、表2。

表1 各组细胞存活率、平均荧光强度和P53比较

表2 各组Cyt-C和P53蛋白相对表达量

图1 各组线粒体膜电位的变化(罗丹明染色，200×)

图2 Western blotting印迹法检测P53、Cyt-C蛋白表达

3 讨论

帕金森病是老年人常见的神经退行性疾病之一，多巴胺神经元广泛的缺失是形成障碍的最重要原因[4-5]。

在帕金森病发生发展中，细胞凋亡是重要的病理性过程[6]。其依赖于胞内和胞外两条信号转导通路，在胞内信号通路中，线粒体起着中心调控作用。

线粒体功能障碍在帕金森病患者中普遍存在。在帕金森病患者的黑质神经细胞和血小板中，均发现线粒体复合物Ⅰ活性降低[7]。线粒体复合物Ⅰ被氧化应激产生的自由基损伤后，功能受到抑制，不能正常产生能量，诱导更多活性氧、自由基生成；而大量的活性氧、自由基又会加快线粒体复合物Ⅰ活性的降低，形成恶性循环[8]。

丁苯酞是我国拥有自主知识产权的国家一类抗脑缺血新药。该药最早从南方水芹菜籽提取物中发现，后经人工化学合成。药理学研究显示，丁苯酞能够重构缺血区微循环，缩小脑梗死面积；能够保护线粒体功能，恢复能量代谢，抑制神经细胞凋亡，具有神经保护作用[9]。丁苯酞能够通过抑制蛋白的高度磷酸化，阻止蛋白异常聚集，保护神经元细胞免受损伤。基础研究和临床研究均表明，丁苯酞对帕金森疾病有确切疗效。

刘建国等通过对4例病例观察发现，丁苯酞对神经变性疾病和神经遗传疾病有治疗作用，可能是通过改善线粒体功能而发挥作用[10]。张霞萍等观察发现，丁苯酞对中晚期帕金森病患者治疗中出现运动波动等并发症和非运动症状有一定疗效[11]。贾敏等通过神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞研究发现，丁苯酞预处理过的SH-SY5Y细胞比单独鱼藤酮诱导的细胞，细胞形态变化小，活性下降程度轻，线粒体膜电位降低幅度小，表明丁苯酞可能有抑制细胞凋亡效应，从而发挥其神经保护作用[12]。张昭文等对帕金森病大鼠模型的研究发现，丁苯酞具有抗氧化和对多巴胺能神经元的保护作用[13]。

本研究显示，丁苯酞预处理的细胞，存活率明显高于单独MPP+诱导的细胞，且呈一定的剂量依赖性。

罗丹明123是一种可透过细胞膜的阴离子荧光染料，可被线粒体吸收。在正常细胞中，能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失；在细胞凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，膜通透性增加，导致膜电位改变，罗丹明123重新释放出线粒体，荧光强度增强。本研究显示，丁苯酞预处理可以稳定线粒体膜电位，从而发挥其神经保护作用，与贾敏等[12]的研究结果一致。

相关研究表明，P53在很多退行性神经病变的神经元死亡中发挥重要作用，尤其是在细胞凋亡信号传导途径调控系统中具有重要作用。由P53介导的凋亡途径主要包括两条[14]：①外源性凋亡途径，主要通过激活位于浆膜的死亡受体，如Fas、DR4、DR5等，促进细胞凋亡；②内源性凋亡途径，P53蛋白活化后，激活线粒体凋亡通路，即Bax蛋白，破坏线粒体膜的完整性，而促使线粒体释放CytC；CytC作为应激传感器被释放到胞质中，与Apaf-1、dATP以及Procaspase-9形成凋亡复合体，最终导致Caspase-9活化；Caspase-9进一步激活下游的Caspase-3，诱导细胞凋亡[15]。

有研究表明，丁苯酞可通过抑制线粒体CytC的释放和Caspase-3的激活，抑制脑缺血诱导的DNA片段化[16]，从而抑制细胞凋亡。赵云霞等发现，丁苯酞预处理原代培养皮层神经元可以明显抑制β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)导致的Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3蛋白的表达上调，Bcl-2的表达下调，且从线粒体释放到胞浆中CytC的表达也明显下降[17]。

本研究显示，MPP+作用细胞后，可能是通过破坏线粒体通透性，引起细胞的凋亡；丁苯酞预处理能抑制MPP+对细胞产生破坏作用。

综上所述，丁苯酞对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞具有保护作用，其机制可能与线粒体有重要联系，可能是通过影响线粒体膜电位的稳定性和调节P53、CytC的表达，抑制细胞凋亡发生。

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Effect of Butylphthalide onApoptosis of SH-SY5Y Cells

ZHAO Su-chen1,WU Qing-wen1,CHENG Yue-fa2,CHEN Juan1,JIA Yu-feng1,MENG Qi3
1.College of Nursing and Rehabilitation of Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Jitang College of Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China;3.West China School of Public Health,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610041,China

Objective To explore the effects of butylphthalide on the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by the 1-methyl-4-phenylpyridinium iodide(MPP+).Methods SH-SY5Y cells were cultured with butylphthalide in the dosage of 1µmol/L,10µmol/L and 20µmol/L for 2 hours,and with MPP+for 24 hours.The viability of cells was measured with trypan blue.The mitochondrial membrane potential was detected with Rhodamine 123.The content of P53 protein was detected with ELISA.The expression of P53 and cytochrome C(CytC)were detected with Western blotting.Results The viability of SH-SY5Y cells increased with the dosage of butylphthalide(P＜0.05),while the mitochondrial membrane potential and the expression of P53 and CytC decreased(P＜0.05).Conclusion Butylphthalide can prevents the SH-SY5Y cells from the injury induced by MPP+,which may associate with the inhibition of apoptosis through the expression of P53 and CytC.

Parkinson's disease;butylphthalide;SH-SY5Y cells;P53;cytochrome C;apoptosis

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.010

R742.5

A

1006-9771(2015)04-0412-05

2014-12-10

2015-03-05)

河北联合大学博士科研启动基金项目(No.35647699)。

1.河北联合大学护理与康复学院，河北唐山市063000；2.河北联合大学冀唐学院，河北唐山市063000；3.四川大学华西公共卫生学院，四川成都市610041。作者简介：赵素晨(1988-)，女，汉族，河北沧州市人，硕士研究生，主要研究方向：神经康复。通讯作者：吴庆文、程月发。E-mail:wxywqw@163.com(吴庆文);arthurcyf@163.com(程月发)。