基于新型光敏剂的光动力治疗在胆管癌中的应用

李 冰，胡贤荣，万 伟，薄志远，吴叶晨，郑 晓，胡 冰

(1.苏州大学研究生院，江苏苏州 215123;2.第二军医大学附属东方肝胆外科医院内镜科，上海 200438)

胆管癌是起源于胆道上皮细胞的恶性肿瘤［1］，生长部位比较特殊，起病隐匿，当出现明显临床症状时，肿瘤往往已经进展为中晚期，绝大部分患者失去根治性手术治疗的机会，预后极差，死亡率高，癌患者的5年生存率平均是5%～10%［2］。更有研究显示胆管癌对化疗、放疗极不敏感［3］，较多临床研究认为胆管癌根治性手术后患者的5年生存也仅有20% ～40%［4］。胆管癌的这些临床特点及治疗现状，使其急需一种新的治疗方法，近年来随着医疗技术发展，光动力等微创疗法的兴起，成为胆管癌治疗的研究热点，而且也取得明显的成效。

光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)是继手术、放疗和化疗之后兴起的治疗肿瘤的新手段，利用肿瘤组织及细胞对光敏剂(photosensilizter，PS)选择性吸收，然后在特定波长光照下激发光敏剂，发生光动力化学反应，生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)为主的杀伤肿瘤细胞活性物质，从而达到治疗肿瘤的目的。PDT于20世纪70年代用于人类肿瘤的治疗，于80年代引入我国，因其对靶组织及损伤程度具有可选择性，正常组织的损伤微小，有明确的临床效果，而受到人们的关注，近年来得以迅速兴起，并广泛应用于各类肿瘤的研究和治疗。

叶绿光I号(YLG I)是桂林晖昂生化药业有限责任公司提供的一种新型光敏剂。化学名为2-1-己氧乙基-2-去乙烯基卟吩e6三钠盐(HCE6)，属于叶绿素类二代光敏剂，分子式为C40H47N4O7Na3，分子量为764.79，最大激发波长652 nm，难溶于有机溶剂，易溶于水。分子结构如图1。

1 材料与方法

1.1 实验材料 PDT-652 nm AB型光动力激光治疗仪由桂林兴达有限责任公司提供，叶绿光I号(YLG I)由桂林晖昂生化药业有限责任公司提供。QBC939系人胆管癌细胞购自上海和元生物技术有限公司。BALB/c裸鼠10只，雌雄各半，四周龄，16～18 g，由第二军医大学动物中心提供并饲养，动物许可证号:SCXK(沪)2013-0016。DMEM细胞培养液、胎牛血清，上海和元生物技术有限公司提供。细胞增殖与毒性检测试剂盒CCK8(批号20140818，Ruian biotech)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 QBC939人胆管癌细胞培养于含10%牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素的DMEM培养基的培养瓶中，置于恒温37℃、5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱中。每24 h更换一次培养液，2 d传代一次。HCE6光敏剂，在实验当天用无血清DMEM培养液稀释成实验浓度。

1.2.2 光毒性与暗度性实验 CCK8检测光毒性以及暗毒性条件下HCE6光敏剂对QBC939人胆管癌细胞增殖活性的影响。取4个96孔板，每个96孔板以竖排为一组，每个板分6组，每组5个样本，取对数生长期胆管癌细胞，将QBC939细胞接种于96孔板中，每孔5 000个，用含牛胎血清的DMEM培养基培养，每孔100μL培养基，当胆管癌细胞贴壁生长后换相应含浓度光敏剂的培养基培养。每板6 组分别换含有不同浓度 0、0.3、0.5、1.0、15、2.0mg·L-1的 HCE6 光敏剂的培养，培养24 h，24 h后弃掉培养基，用生理盐水冲洗2次，加入无药培养基，4个96孔板板分别接受光照强度剂量分别为0.6 J ·cm-2(0.1 W，10 min)、1.8 J ·cm-2(0.3 W，10 min)、2.7 J ·cm-2(0.9 W，5 min)，5.4 J ·cm-2(0.9 W，10 min)光强剂量的 PDT 治疗，48h后弃掉培养基，生理盐水冲洗2次，加入10∶1无血清培养基与CCK-8试剂混合液每孔150μL，2 h后在酶标仪上测OD值(450 nm)，测量3次，此过程均为避光。暗毒性实验时不进行PDT治疗，加完光敏剂24 h后，弃掉培养基，用生理盐水冲洗2次，加入无药培养基培养48 h后直接测量细胞增殖活性，其步骤与光毒性实验相同。增殖率数据计算处理后，用GraphPad Prism5绘制增殖率曲线图。增殖率=(对照组OD-实验组OD)/对照组OD×100%。

1.2.3 建立QBC939人胆管癌荷瘤裸鼠模型 培养瓶的细胞总数计数到5×107以上时，培养液稀释制成1×1010·L-1的细胞悬液5 mL。每只裸鼠于臀部皮下注射浓度为1×1010·L-1的细胞悬液0.15 mL。接种后每2 d观察动物一次，到观察到有肿瘤长出后，改为每天观察一次，并记录肿瘤长径(L)、短径(D)。

1.2.4 光动力治疗实验与病理切片制作 取肿瘤长径(L)1 cm左右裸鼠，分对照组、实验组两组。两组分别尾静脉分别注射0、0.5 mg·kg-1光敏剂，24 h后PDT治疗，光源距瘤体2 cm，光强度120 J·cm-2，功率0.2 W，治疗20 min。光动力治疗后每天观察裸鼠有无角膜光敏感以及肿瘤以外皮肤变化，并分别第1、3、7、10天观察并记录瘤块长短径，GraphPad Prism5绘制瘤体变化曲线。肿瘤体积计算公式为:V=1/2×L×D2。PDT治疗第10天处死裸鼠，取肿瘤置于10%甲醛中固定，浸蜡包埋，制作切片，并HE染色，光镜下观察。

1.3 统计方法 采用SPSS 20统计软件包处理分析数据，所有数据用均数±标准差即(±s)表示。采用方差分析，多个均数间比较采用LSD-t检验，显著性水准为0.05，即P＜0.05差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 光动力处理后QBC939系胆管癌细胞增值率变化以及光敏剂的光毒性与暗度性比较 在QBC939系人胆管癌细胞水平实验中，特定光照强度下，随着培养液中光敏剂浓度含量的增加，细胞的存活率逐渐是降低的，但当光敏剂浓度1.5 mg·L-1后，在增加培养基中光敏剂浓度，这个数值不再变化，可能原因是这种胆管癌细胞对光敏剂吸收有饱和现象(图2)。在a、b两个光照剂量下无论光敏剂浓度怎样增加，PDT都无法达到完全抑制，当把光照剂量调到 2.7 J·cm-2(0.9 W，5 min)，光敏剂浓度1.5 mg·L-1时，可完全抑制细胞增殖，这可能是前者光照剂量不够。当光照强度继续增加到图d剂量5.4 J·cm-2(0.9 W，10 min)时，细胞增殖率曲线与c图无差异，这可能与细胞对光敏剂的吸收量以及光照吸收也有饱和现象有关。可见这类光敏剂在抑制QBC939细胞时存在最适浓度和光照剂量，最适完全抑制浓度为1.5 mg·L-1，最佳光照剂量为2.7 J·cm-2(功率0.9 W，5 min)，超过这些剂量范围PDT对QBC939细胞的抑制效果不再变化。图2，a、b、c、d 四组中1.5 mg·L-1与 2.0 mg·L-1浓度组间细胞存活率无统计学差异(P＞0.05)，其余浓度组间均有统计学差异(P＜0.05)。

暗毒性与光毒性在暗度性实验中，可见到在没有激光下，对胆管癌细胞抑制作用十分微弱，而有激光治疗下，对胆管癌细胞有明显的有抑制作用。暗毒性下，QBC939胆管癌细胞增殖率下降斜率不明显，而光毒性下，这个斜率明显，可见光敏剂的暗度性对癌细胞抑制甚微，而光毒对癌细胞的抑制十分显著(图3)。暗毒性曲线，0 mg·L-1与0.3 mg·L-1间细胞增殖率比较无统计学差异(P＞0.05)，1.5 mg·L-1与 2.0 mg·L-1间细胞增殖率比较无统计学差异(P＞0.05)，其余浓度组有明显统计学差异(P ＜0.05)。光毒性曲线，1.5 mg·L-1与 2.0 mg·L-1间细胞增殖率比较无统计学差异(P＞0.05)，其余浓度组有明显统计学差异(P＜0.05)。

2.2 裸鼠荷瘤瘤体变化对比 图4，A图为光动力10 d后光动力组(下)与对照组(上)裸鼠肿瘤体积比较，B图为相应裸鼠处死后摘取的瘤块;两组裸鼠上面一排为对照组，下面一排为实验组。实验组瘤块体积(0.5 ±0.010)cm3，对照组瘤块体积(2.25 ±0.015)cm3，实验组与对照组有明显统计学差异，P＜0.05。动物模型实验中，PDT前各组肿瘤大致相似平均(0.073±0.012)cm3，无明显差异。实验处理第3天开始，实验组和对照组有明显肿瘤体积差异(P＜0.05)，到第10天，实验组与对照组体积差异明显，实验组瘤块体积(0.5 ±0.010)cm3，而对照组为(2.25±0.015)cm3。实验组和对照组除光照处外，均无皮肤变色坏死，也无角膜光敏感。

图5，光动力治疗后，不同时间(1、3、7、10 d)，实验组与对照组瘤体变化曲线。PDT后不同时间点，对照组瘤体平均体积明显大于实验组，对照组生长曲线斜率明显高于实验组。可见对照组瘤体生长速度明显高于实验组。实验组与对照组在PDT后同一天，以及各组间PDT后不同时间段瘤块体积大小，均有显著统计学差异，P＜0.05。

2.3 实验组与对照组瘤体病理对比 图6，A(100倍)、B(400倍)为对照组瘤块病理切片HE染色光镜下视图。C(100倍)、D(400倍)为实验组瘤块病理切片HE染色光镜下视图。对照组(A、B)瘤组织可见瘤组织中央部位无坏死区域，边缘瘤细胞增殖旺盛，瘤组织外有包膜，肿瘤细胞大而且细胞核深染，核浆比例大，细胞核异型性非常显著，可观察到核分裂。实验组(C、D)瘤组织内部见大片的变性、坏死区域，肿瘤边缘可见残存肿瘤细胞，肿瘤组织内可见出血，肿瘤细胞核可见固缩、碎裂及溶解，细胞可呈崩解状态。

3 讨论及结论

PDT对肿瘤组织及细胞的杀伤机制主要有三方面［5］:(1)诱导组织细胞凋亡与坏死。Cao 等［6］在QBC939系胆管癌细胞水平和荷瘤裸鼠模型实验中，发现经光动力治疗后肿瘤与对照组相比细胞凋亡率明显增高，细胞内细胞色素C、caspase-9和caspase-3表达明显增高，证明了光动力可诱导QBC939系胆管癌细胞细胞色素 C、caspase-9和caspase-3的释放，并激活诱导QBC939细胞的的坏死和凋亡。(2)对肿瘤微血管损伤。PDT能导致炎性反应和炎性因子的释放，引起血管收缩、血流停滞，致使肿瘤组织水肿、缺血、坏死，从而达到杀伤肿瘤的目的［7］。(3)诱发免疫及炎症。PDT可引起组织内免疫炎症相关因子TNF、IL22等细胞因子表达。PDT的免疫作用涉及肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞及细胞因子等方面［8］。

自20世纪80年代从HpD(血卟啉衍生物)中分离纯化出 PhotofrinⅡ(光敏素Ⅱ)［9］，为目前临床上常用的一代光敏剂，对应的激发波长630 nm。这类光敏剂在胆管癌的基础研究国内外都有很多，无论细胞水平还是活体动物方面成效都很显著。一代光敏机在临床实验也相当成熟，但在国内应用没有国外多，而且在胆管癌临床治疗中还不够理想。一些临床应用显示这类光敏剂有两个重要局限，皮肤光敏感长(3个月)和杀伤肿瘤深度有限(4～6 mm)［10］，而临床研究显示胆管癌大多侵犯深度为7～9 mm［11］，可见杀伤深度是其重大弊端。二代光敏剂最早出现于20世纪80年代，近年来新发光敏剂频出不断。与一代光敏剂相比，成分单一、分子结构明确、最大红外吸收波长更长，吸收系数高，ROS产率高，对肿瘤的杀伤效果更强，副作用小，这类光敏机在国外研究和应用都比较频繁，但在国内还尚未有用于临床治疗的报道。常用于胆管癌研究和治疗的有ALA、mTHPC、HYP等，这些光敏剂与一代光敏剂比较，在人体内的残留时间明显降低，对皮肤的光毒性也明显减小。Kniebühler等［12］用 mTHPC 光动力(0.032 ～0.063 mg·kg-1，652 nm，50 J ·cm-2)联合ERCP支架植入治疗13个无法手术患者，光动力治疗后患者平均生存期可达13个月，并用荧光动力学测量空腔黏膜光敏剂最大浓度时间是注射光敏剂后3.85 d，但皮肤光敏感时间长是其主要缺点。三代光敏剂是于二代光敏剂基础上结合某些生物或者化学成分，如抗体、氨基酸、糖、脂类、蛋白质等，以增强光敏剂对肿瘤组织的选择性或生物相容性［13］，但这类光敏剂仍处于实验室研究中，国内外未见临床应用报道。其中有在胆管癌细胞水平的一项研究，Lee等［14］用壳聚糖和熊去氧胆酸制作的纳米材料，与光敏剂Ce6(二氢卟吩E6)形成离子结合物，用于HuCC-T1系胆管癌细胞光动力治疗研究，他的结果表明纳米材料能增强胆管癌细胞对光敏剂的吸收以及胆管癌细胞内ROS产生量。

HPPH为二代光敏剂，在665 nm处有很强的吸收峰，这些特性使其比卟吩母钠(630 nm)和m-THPH(652 nm)有更强的组织穿透性［15］。已用于肺癌、食管癌、头面颈癌、膀胱癌、胃癌等多种实体肿瘤的治疗，但未见在胆管癌中的研究及应用。叶绿光I号(YLGI)是HPPH衍生物，其增加水溶性，却降低了脂溶性，更容易在活体内代谢。YLGI是叶绿素类二代光敏剂，分子式为C40H47N4O7Na3，分子量为 764.79，最大激发波长 652 nm，难溶于有机溶剂，易溶于水，易于在人体内代谢，所以最大优点就是代谢快，皮肤光敏感时间短，副作用微小。但由于其脂溶性降低，可能会降低其在细胞内的积累，以及光毒性。无论细胞水平还是裸鼠荷瘤动物实验，YLG I-PDT对胆管癌生长抑制效果十分明显，而且暗度性微弱，也未见到皮肤光敏感。本实验已在细胞水平和活体动物实验上看到了其明显的抑制肿瘤效果和相对安全性，但其在临床上效果仍需要大量基础和临床实验去验证。

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