肿瘤坏死因子-α削弱谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白质合成的途径

周济宏 洪志坚 胡心宝 解伟光 于 攀 李幼生

(1.南京军区南京总医院烧伤整形科，江苏 南京 210002；2.南京军区南京总医院解放军普通外科研究所，江苏 南京 210002)

肿瘤坏死因子-α削弱谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白质合成的途径

周济宏1洪志坚1胡心宝1解伟光1于 攀1李幼生2

(1.南京军区南京总医院烧伤整形科，江苏 南京 210002；2.南京军区南京总医院解放军普通外科研究所，江苏 南京 210002)

目的：研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白质合成及对细胞膜谷氨酰胺载体ASCT2 mRNA和蛋白表达的影响，揭示TNF-α影响谷氨酰胺促蛋白质合成的途径。方法：30只雄性SD大鼠，随机分为3组：对照组, 谷氨酰胺组 (Gln组) 和谷氨酰胺+肿瘤坏死因子组 (Gln+TNF-α组)。所有大鼠均行72 h全肠外静脉营养（TPN）。对照组给予普通TPN；Gln组给予添加丙氨酰谷氨酰胺二肽的肠外营养，谷氨酰胺剂量为0.3 g•kg-1•d-1；Gln+TNF-α组TPN方法同Gln组，并于实验结束前24 h持续静脉滴注TNF-α（5 µg•kg-1•h-1）。所有大鼠均于取材前0.5 h一次性静脉注射L-15N 亮氨酸1.0 mmol/kg。TPN后72 h分别取血和下肢骨骼肌，测定血浆TNF-α浓度（双抗体夹心ELISA法）、血浆和骨骼肌Gln浓度（高效液相色谱分析法）、骨骼肌蛋白质分数合成率（质谱仪测定后计算）、载体ASCT2 mRNA（RT-PCR方法）及蛋白（Western Blot法）表达水平。结果：Gln+TNF-α组血浆TNF-α浓度显著高于其他两组；Gln+TNF-α组血浆及骨骼肌中谷氨酰胺浓度最高；Gln组和Gln+TNF-α组骨骼肌中蛋白质合成率均高于对照组，并且Gln组最高，各组间差异显著（P＜0.01）。对照组ASCT2 mRNA表达最低（P＜0.01），而另两组间差异无显著性（P＞0.05）。3组ASCT2蛋白均有表达，Gln组显著高于对照组和Gln+TNF-α组（P＜0.01）。结论：TNF-α能够升高大鼠血浆及骨骼肌中谷氨酰胺的浓度，削弱谷氨酰胺的促蛋白质合成作用；其途径是抑制谷氨酰胺载体蛋白的合成，降低了骨骼肌细胞对谷氨酰胺摄入，导致组织蛋白质合成下降。

肿瘤坏死因子-α 谷氨酰胺 全肠外营养 蛋白质合成率 谷氨酰胺载体 ASCT2

谷氨酰胺（Gln）是健康机体中含量丰富的游离氨基酸，不仅是蛋白质合成的原料，还能够诱导细胞保护，调节免疫应答，预防器官损伤。在危重患者中，由于蛋白质大量消耗，血中谷氨酰胺浓度至少下降25%～35%[1-2]，这种现象尤其多见于大面积烧伤患者。机体在创伤、感染等应激状态时，虽然骨骼肌可以释放大量谷氨酰胺，为快速增殖细胞提供能量，作为前体合成核苷酸，并调节酸碱平衡，但此时仍需补充外源性谷氨酰胺。研究证实，补充外源性谷氨酰胺，能够有效地预防和治疗脓毒症和其他损伤所诱发的多器官功能障碍综合征[1-4]。但近来也有研究显示，在感染状态下，尤其在感染的早期，应用谷氨酰胺后，其在降低重度感染患者病死率、缩短住院时间、减轻炎症反应、促进感染状态下蛋白质合成等方面的效果并不理想[5-6]。血液中的谷氨酰胺必须首先顺利进入功能细胞才能发挥作用，而其跨膜转运又必须依赖细胞质膜上谷氨酰胺载体的正常结构和功能[7]。TNF-α是脓毒症的重要介质[8]。本研究拟探讨TNF-α对谷氨酰胺促蛋白质合成的影响及其可能途径，为提高感染状态下谷氨酰胺的疗效提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料 成年健康雄性封闭群SD大鼠（中国科学院上海实验动物中心提供），清洁级，体重120～180 g。术前在清洁级大鼠饲养室以标准实验大鼠全价颗粒饲料（江浦实验动物饲料厂）饲养至少1周以适应环境。饲养室温度18～22 ℃，每日光照12 h（6:00-18:00），自由饮水。 L-15N亮氨酸购于美国剑桥同位素实验室（Cambridge Isotope Laboratories）；丙氨酰谷氨酰胺二肽、脂肪乳（20%Intralipid）、10%乐凡命（10%Novamin）均购于华瑞制药有限公司； TNF-α购于美国Peprotechec公司；哺乳动物总蛋白抽提试剂盒购自上海星汉生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 动物分组与处理 30只雄性SD大鼠随机分为3组：对照组、谷氨酰胺组 (Gln组)和谷氨酰胺+ TNF-α组 (Gln+TNF-α组)。3组大鼠均按照文献[9]的方法行左颈外静脉置管并连接旋转输液装置，然后置代谢笼中，禁食。手术当天予以5%葡萄糖注射液100 ml/kg静滴，次日开始经颈外静脉行72 h全肠外营养（TPN），营养液每日使用前配制，配方见表1。每次更换注射器，避免空气进入管道，输液管道连接处酒精消毒。对照组行普通TPN；谷氨酰胺组行含有谷氨酰胺（0.3 g•kg-1•d-1，由丙氨酰谷氨酰胺二肽提供）的TPN； Gln+TNF-α组同样应用含有谷氨酰胺的TPN，但在实验结束前24 h持续静滴TNF-α，速度5 µg•kg-1•h-1。所有大鼠均在取材前0.5 h，一次性静脉注射示踪剂L-15N亮氨酸1.0 mmol/kg以测定骨骼肌蛋白质合成率。

表1 全肠外营养配方

1.3 标本处理与指标检测 于TPN 72 h在麻醉状态下取大鼠下腔静脉血5～6 ml，1 500 r/min离心5 min，取血浆，同时取左后肢股四头肌肌群的肌肉组织2.5～3.0 g，均-20 ℃保存。

1.3.1 血浆TNF-α浓度测定 采用双抗体夹心ELISA法,试剂盒为上海沪鼎生物科技公司生产。

1.3.2 谷氨酰胺浓度测定 采用高效液相色谱分析法[10]。血浆直接超滤；取肌肉组织0.2 g研磨后用流动相稀释后超滤去蛋白。取滤液衍生，衍生剂为邻苯二甲醛（衍生60～90 s），衍生后进样，根据峰面积及肌肉的重量计算出谷氨酰胺浓度。

1.3.3 骨骼肌蛋白质分数合成率（FSR）的测定 取骨骼肌2.0 g，液氮冷冻，研磨成粉，按照文献[10]的方法进行游离及结合氨基酸的分离、制备质谱仪测定所需前体及质谱仪测定15N丰度，根据以下公式计算FSR：

其中EB（t）、EB（o）为实验起始及实验结束时的结合氨基酸（所测蛋白质）丰度，EF(t)系前体池氨基酸丰度。EB（o）系固定值0.364。

1.3.4 谷氨酰胺载体ASCT2 mRNA表达的测定 采用RT-PCR方法。按照Invitrogen 公司的Trizol 操作说明书进行总RNA抽提，紫外分析法测定抽提RNA的浓度；逆转录获取cDNA，操作按照Promega 公司的M-MLV 操作说明书进行；荧光定量PCR仪（FTC2000， Funglyn Biotech Inc 加拿大）上进行荧光定量PCR反应。ASCT2引物分别是：5’-GCAGCCTAGACCTGGGATCAC-3’（上游引物）及5’-GCGGTCTTTGATTCCCTGAA-3’（下游引物），TaqMan探针为：fam+ATCT TGGGTTCCCGGAGCCAGACAT+tamra (上海闪晶分子生物科技有限公司合成)。实时荧光定量PCR反应在50 μl的反应体系中进行：TaqmanPCR反应通用缓冲液25μl，引物(25 pmol/μl) 0.6 μl×2，探针0.3 μl，cDNA模板1μl，DEPC水22.5 μl。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，扩增循环 94℃×20 s，60℃×30 s，共30个循环。扩增完成后，记录每组相应的Ct值并进行数据统计。

1.3.5 ASCT2蛋白表达的测定 采用Western-Blot方法。用抽提试剂盒获得骨骼肌组织总蛋白，并检测浓度，取5 μg蛋白裂解液，于100 ℃加热3 min后，进行常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电转至PVDF膜上，用质量浓度为5%的脱脂奶粉室温下封闭2 h，加入1:500稀释的羊抗鼠ASCT2多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），室温下孵育过夜，TBST缓冲液洗膜后，加入1:10 000稀释的驴抗羊IgG-HRP抗体(美国Santa Cruz公司），室温下孵育1 h，TBST缓冲液洗膜后，ECL法显色。以Actin作为内参照，Quantity One分析软件（Bio-Rad 1000 Alfred Nobel Drive Hercules, CA 94547）将图片上每个特异条带灰度值数字化。

1.4 统计学分析 定量数据以x±s表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两多重比较采用Dunnett's T3 检验。采用SPSS19.0软件进行统计分析。P＜0.05为差异具有显著性。

2 结 果

2.1 血浆TNF-α浓度的变化 TPN后72 h，Gln+TNF-α组血浆TNF-α浓度显著高于其他两组（P＜0.01，见表2）。

2.2 血浆和骨骼肌中谷氨酰胺浓度的变化 血浆和骨骼肌中谷氨酰胺浓度均以Gln+TNF-α组最高，Gln组次之，对照组最低，各组间差异显著（P ＜0. 01，见表2）。

2.3 骨骼肌FSR的变化 Gln组最高，对照组最低，Gln+TNF-α组显著低于Gln组，各组间差异显著（P ＜0.05或P ＜0.01，见表2）。

表2 3组血浆TNF-α、谷氨酰胺浓度及骨骼肌Gln浓度和FSR的变化（x±s，n=10）

2.4 TNF-α对ASCT2 mRNA表达的影响 对照组ASCT2 mRNA表达最低，显著低于其他两组，Gln+TNF-α组ASCT2 mRNA表达高于Gln组，但差异无显著性（见图1）。

图1 3组骨骼肌ASCT2 mRNA的表达

2.5 TNF-α对ASCT2蛋白表达的影响 各组ASCT2蛋白均得以表达（见图2），其中对照组显著低于Gln组和Gln+TNF-α组，Gln组高于Gln+TNF-α组，差异有显著性（见图3）。

图2 3组骨骼肌ASCT2蛋白表达的Western Blot结果

图3 TNF-α对骨骼肌ASCT2蛋白表达的影响

3 讨 论

感染一直是困扰世界人口健康和医疗质量的重大难题，人口老龄化、免疫抑制、多重耐药等诸多因素，均可导致重度感染的发生。感染能诱发发热、白细胞升高、低血压等症状，最终导致多器官系统功能衰竭。在住院患者中，感染的发生率和重度感染(脓毒症)引起的病死率正在逐年增加。最近的统计表明，脓毒症直接导致的病死率可高达20% ～50%，而多器官功能障碍综合征（MODS）正是重症监护病房（ICU）中患者的主要死因[1-3]。因此，如何防治感染一直是医学界的一项重要研究课题。

有大量的研究支持在危重患者的治疗中使用谷氨酰胺，谷氨酰胺可以降低患者感染发病率和病死率，并且剂量越大疗效越好[2-3]。 但近年来也用一些研究显示，在感染状态下使用谷氨酰胺疗效并不理想，增加外源性谷氨酰胺不一定能促进骨骼肌的蛋白质合成[5]；为重症患者补充谷氨酰胺不能对患者的蛋白质代谢产生影响。Ebach等[8]报道，使用谷氨酰胺只能增加感染大鼠骨骼肌中游离谷氨酰胺的浓度，而不增加蛋白质合成。这些研究结果与我们在临床上观察到的现象一致[5,10]。

TNF-α是在重度感染中起关键作用的因素[7]。本研究中，我们通过给大鼠持续静脉滴注TNF-α来模拟重度感染状态，可使血浆中TNF-α升高到很高的水平，与感染状态相似。我们发现，使用肿瘤坏死因子和谷氨酰胺可以显著升高血浆和骨骼肌组织中游离谷氨酰胺的浓度。 同样在其他模拟感染的试验中，在感染早期游离谷氨酰胺浓度并不降低，反而升高，这与TNF促蛋白质降解有关[11]。就蛋白质合成而言，我们发现，Gln组的FSR较未应用Gln的对照组显著升高，说明谷氨酰胺可以促进机体蛋白质合成，这与其他的实验结果相符[12]。另外，Gln+TNF-α组FSR明显低于Gln组，进一步表明谷氨酰胺的这种促蛋白质合成的作用可以被TNF-α抑制。可见，感染时，细胞外高浓度谷氨酰胺并不能被很好地利用。

谷氨酰胺首先是蛋白质合成的底物[1-3]，细胞外高浓度的谷氨酰胺能否顺利进入细胞发挥作用，取决于载体功能是否正常。我们前期离体研究已经证实，TNF-α抑制氨基酸载体对谷氨酰胺的转运[13]。载体ASCT2是系统ASC的一种载体，对转运谷氨酰胺有高度的亲和性，在组织细胞中有广泛的分布[14-18]。本研究中我们发现，TNF-α能够促进载体ASCT2的mRNA合成，可见其对载体功能的影响并非发生在转录水平，这和我们的前期离体研究相符[19]。蛋白质功能的改变无非两种途径，一种是表达量的改变，另一种是其功能位点的构象变化。我们研究发现，炎症因子抑制谷氨酰胺载体蛋白的表达，这说明转运载体绝对数量是下降的，但其表达量的下降幅度并不显著。我们在小肠研究中却发现，转运蛋白数量并不显著下降[20]。转运功能的受抑势必存在着载体蛋白结构的改变。炎症因子究竟通过何种途径抑制谷氨酰胺载体蛋白的转运功能，其分子机制仍不清楚。

总之，本研究显示，炎症因子能够抑制谷氨酰胺的促骨骼肌蛋白质合成作用，其途径是炎症因子抑制氨基酸载体的转运功能，导致谷氨酰胺不能顺利进入细胞，这种抑制部分发生在翻译水平，当然究竟通过何种途径来实现，还有待进一步研究证实。

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Study of the effects of tumor necrosis factor-α in decreasing the protein synthesis of skeletal muscle stimulated by glutamine and its pathway in rats

Zhou Jihong*，Hong Zhijian，Hu Xinbao，Xie Weiguang ，Yu Pan，Li Yousheng.

*Department of Burns and Plastic Surgery，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region， Nanjing 210002，Jiangsu，China

Li Yousheng(E-mail: liys@medmail.com.cn)

Objective: To study whether and how tumor necrosis factor-α (TNF-α) affects glutamine-enhanced protein synthesis of skeletal muscle, and the effects of TNF-α on the expression of mRNA and protein of ASCT2, a kind of membrane transportor of glutamine. Methods: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: control group, glutamine group (Gln group,), and Gln+TNF-α group. All rats received total parenteral nutrition (TPN) components for 3 days. The animals of the control group were only supplemented with general TPN, while those in the Gln group were given glutamine-enriched (0.3 g•kg-1•d-1, glutamine was supplied by alanyl glutamine dipeptide ) TPN, and those of the Gln+TNF-α group were supplemented with glutamine-enriched TPN, and then they received intravenous injection of 5 µg•kg-1•h-1of TNF-α in the last 24 hours. In the last 30 minutes of TPN, all rats received intravenous injection of 1.0 mmol/kg of L-15N leucine. The blood and skeletal muscles were sampled 72 hours after TPN, the plasma concentrations of TNF-α, the content of glutamine in plasma and skeletal muscles, the fractional synthesis rate of skeletal muscles, the mRNA and protein expression of ASCT2 were assessed . Results: The plasma level of TNF-α in the Gln+TNF-α group was the highest among 3 groups (P ＜0.01). The concentration of glutamine in plasma and skeletal muscles was more elevated in the Gln+TNF-α group than that in the other two groups (P＜0.01). The fractional synthesis rate of skeletal muscles increased more significantly in the Gln+TNF-α and Gln groups than that in the control group, and it was highest in the Gln group (P＜0.01). The mRNA expressionof ASCT2 in control group was statistically significantly lower than that in the other two groups (P ＜0.01), but the difference was not significant between Gln+TNF-α and Gln groups (P＞0.05). The protein expression level of ASCT2 in Gln group was statistically higher than that in the control and Gln+TNF-α groups (P ＜0.01). Conclusions: TNF-α could increase the concentration of glutamine in plasma and skeletal muscles, attenuate protein synthesis in skeletal muscle stimulated by glutamine in rats. The pathway maybe inhibition of protein synthesis of glutamine transporter by TNF-α, and reduction of the uptake of glutamine into target cells. This inhibition could restrain the protein synthesis.

Tumor necrosis factor-α Glutamine Total parenteral nutrition Fractional synthesis rate Glutamine transporter ASCT2

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 03. 006

2015-04-03)

李幼生，主任医师（E-mail:liys@medmail.com.cn）