热预处理对超负荷训练大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响①

杨翼，李章华，石武谛，柳华，张杰

热预处理对超负荷训练大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响①

杨翼1，李章华2，石武谛1，柳华1，张杰1

目的观察热预处理(HP)对超负荷训练大鼠心肌蛋白激酶C(PKC)δ、PKCε表达的影响。方法3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠25只分为对照组(n=5)、训练组(n=10)和HP组(n=10)。超负荷训练8周后应用免疫组化法、Real-time PCR和Western blotting检测心肌组织PKCδ、PKCε表达。结果三种检测方法均显示，训练组大鼠心肌PKCδ表达较对照组和HP组增高(P＜0.05)。Real-time PCR与免疫组化检测结果显示，训练组PKCε表达低于对照组和HP组(P＜0.05)；Western blotting结果显示三组PKCε表达无显著性差异(P＞0.05)。结论在热预处理心肌保护效应中，PKC可能发挥了重要的作用。

热预处理；心肌；蛋白激酶C；过度运动；大鼠

[本文著录格式]杨翼，李章华，石武谛，等.热预处理对超负荷训练大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(1):49-53.

CITED AS:Yang Y,Li ZH,Shi WD,et al.Effects of heat preconditioning on expression of protein kinase C in myocardium of rats after overload exercise[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):49-53.

自1986年Murry等首次提出心脏预处理(preconditioning,PC)概念开始，众多研究结果证实，心脏预处理能激活生物体自身内源性保护机制，产生明显的心脏保护效应，使其可以对其后受到的较为严重的缺血、缺氧现象产生良好的耐受[1]。目前心脏预处理方法已经从单一的缺血预处理发展到缺氧预处理、热预处理、药物预处理(包括中、西药)、针灸预处理及电刺激预处理等多种形式，呈现出迅猛发展的态势。热预处理(heat preconditioning,HP)是近年发展起来的一种新型预处理方法。研究表明，适当的热预处理可以有效调动生物体的自我保护机制，产生心肌保护效应，使心肌在随后处于严重缺血、缺氧状态时，仍然不会产生严重的不可逆性心肌损伤，其作用可能涉及多种机制[2-5]。

蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)在心脏预处理发挥心肌保护效应的过程中起着关键作用，是多种因素作用的共同通路。目前发现的PKC家族至少有三大类十余种亚型，但并非所有种属都拥有相同的PKC亚型，也不是所有的PKC亚型都参与预处理的细胞信号传导。PKCδ、PKCε是大鼠和人类共有的两种PKC亚型。近年发现，它们与心脏预处理的心肌保护效应关系密切，在心肌缺血再灌注损伤过程中起着几乎相反

的作用：PKCε激活可对心肌产生保护作用[6-7]，PKCδ激活则会诱导细胞凋亡并引起细胞死亡[8-10]。在前期实验中我们发现，超负荷训练引起的心肌损伤与PKCδ、PKCε表达异常有关，它可能也是超负荷训练导致心肌损伤的作用机制之一[11]。而热预处理可以调节心脏内源性保护物质分泌，调控心肌凋亡基因表达，预防心肌缺血局部的炎性反应，从而抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤程度[12]。本实验拟观察热预处理对超负荷训练大鼠心肌PKCδ、PKCε表达的影响，以了解热预处理心肌保护效应的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性Sprague-Dauley大鼠25只，体质量(200±20)g，3月龄，由武汉大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK(鄂)2003-0004。分笼饲养，每笼4只，标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮食。动物室温度22～28℃，相对湿度50%～65%。分为A组(对照组，n=5)、B组(训练组，n=10)和C组(热预处理组，n=10)。A组大鼠正常饲养，不予任何处理；B、C组大鼠均予以超负荷训练；C组大鼠在每周训练前行热预处理。

1.2 实验试剂与仪器

免疫组化试剂盒、DAB、生物素标记山羊抗兔IgG、二甲苯、无水乙醇、过氧化物酶阻断剂、苏木素复染液等试剂，Trizol、dNTPs(10 mmol/L)、随机引物(25 pmol/μl)、逆转录酶、Taq酶、ddH2O：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。TdT酶：PROMEGA公司。SYBR Green I：INVITROGEN公司。System 9600：PERKIN ELMER公司。PRISM 7700 Sequence Detector：ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 超负荷训练

开始正式训练前，先让大鼠适应性游泳训练1周，在无负重的情况下每天游泳30 min。然后开始正式训练。正式训练第1周大鼠不负重，每天游泳120 min。正式训练第2周游泳时间维持120 min，在第1天和第2天，大鼠尾部负重其体重1%的砝码；第3天和第4天，尾部负重其体重2%的砝码；第5天和第6天，尾部负重其体重3%的砝码。第3周游泳时间仍然为120 min，第1天和第2天，尾部负重其体重4%的砝码；第3天和第4天，尾部负重为起体重5%的砝码。然后在此负重下进行力竭游泳训练。期间发现有力竭表现时(在水下10 s不能浮上)，捞上水面休息5 min后，继续训练至满120 min。这种训练模式一直持续到第7周。第8周每天上午和下午各进行1次训练，每次120 min，负重其体重5%的砝码。

1.3.2 热预处理

C组动物每周训练的前一天进行热预处理，恢复24 h后开始训练。大鼠麻醉后放在45℃恒温箱中，直到大鼠直肠温度达到(41.5±0.5)℃，持续15 min。室温下恢复24 h。剔除死亡和精神萎靡的大鼠，剔除的大鼠及时补充。

1.4 免疫组化检测

末次训练后24 h内处死大鼠，取出心脏，矢状位剖开，置4%多聚甲醛中固定48 h，梯度酒精脱水、包埋、切片、脱蜡，梯度酒精水化，按PKCδ、PKCε免疫组化试剂盒操作说明进行免疫组化染色。心肌组织中出现黄染为阳性。阴性对照用0.01 mol/L PBS代替一抗。采集图像，IPP 6.0图像分析软件对图像进行分析。选取5个待测区域，测定阳性区域积分光密度(IOD)和总面积Area(Sum)，计算阳性区域平均光密度(MOD)。

1.5 Real-time PCR检测

采用Trizol按试剂盒说明提取RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度，电泳法检测其完整性。

β-actin和PKCδ、PKCε引物序列和长度如表1。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。

表1 引物序列、长度

逆转录体系：5×Buffer 4 μl，dNTP 1 μl，RNA 3 μl，Oligo(dT)1 μl，逆转录酶0.5 μl，ddH2O 10.5 μl，共20 μl。逆转录程序：42℃保温60 min。95℃

5 min，4℃1～5 min，反应产物迅速放入-20℃长期冻存。

荧光定量PCR体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，ddH2O 18 μl，dNTPs(10mmol/L)0.5 μl，Forward Primer(20 pmol/μl)2 μl，Reverse Primer(20 pmol/μl) 2 μl，Taq酶(2 U/μl)0.5 μl，SYBR Green I(10×)1 μl，Template cDNA 2 μl，共25 μl。β-actin反应条件：预变性94℃2 min，变性94℃30 s，退火63℃30 s，延伸72℃30 s，共35个循环。PKCδ反应条件：预变性94℃2 min，变性94℃30 s，退火64℃30 s，延伸72℃30 s，共35个循环。PKCε反应条件：预变性94℃2 min，变性94℃30 s，退火57℃30 s，延伸72℃30 s，共35个循环。

结果以2-ΔCt表示。

1.6 Western blotting

按BCA蛋白质定量试剂盒说明提取蛋白并测定浓度。取蛋白80 μg沸水浴5 min后进行电泳蛋白分离，转移至醋酸纤维素薄膜。室温下脱脂奶粉封闭2 h，加入用抗体稀释液稀释的β-actin(1∶1000)、PKCδ (1∶100)、PKCε(1∶100)抗体，4℃摇床孵育过夜。TBST漂洗3次，加入二抗(1∶4000)，室温摇床上温育1.5 h。TBST漂洗3次，ECL显色，显影定影。用Quantity One分析软件进行灰度分析，记录目的蛋白与内参蛋白比值。每组重复3次。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 免疫组化

A组PKCδ阳性细胞极少，阳性表达大多在胞浆中；B组和C组PKCδ在胞浆中和胞膜上均有表达，尤其是B组(图1)。三组大鼠心肌PKCδ两两比较均有显著性差异(P＜0.05)。

B组心肌组织PKCε阳性细胞极少，A组和C组PKCε在胞浆中和胞膜上均有阳性表达(图2)。B组心肌PKCδ表达低于A和C组(P＜0.05)。见表2。

表2 两组心肌PKCδ、PKCε比较(MOD)

图1 大鼠心肌PKCδ表达(免疫组化，400×)

图2 大鼠心肌PKCε表达(免疫组化，400×)

2.2 Real-time PCR

B组心肌PKCδ mRNA表达显著高于A组和C组(P＜0.001)，PKCε mRNA表达显著低于A组和C组(P＜0.001)。见表3。

表3 两组心肌PKCδ、PKCε mRNA比较(2-ΔCt)

2.3 Western blotting

B组PKCδ蛋白表达显著高于A组和C组(P＜0.001)；心肌中PKCε蛋白表达三组间无显著性差异(P＞0.05)。见表4。

表4 两组心肌PKCδ、PKCε Western blotting比较(/β-actin)

3 讨论

保护运动员免在运动训练中发生严重的损伤，是每个教练员和运动员必须解决的问题。运动员的训练时间越长，这个问题越严重，解决起来就越困难。近年来，本课题组在系统研究了超负荷训练致心脏变化相关机制的基础上[11]，借鉴临床心血管领域研究成果，将预处理方法引入运动训练，已初步取得一些的实验数据[11-13]。

热预处理是近年来发展较快的一种预处理方法。研究发现，热预处理在提高机体耐受高温能力的同时，也能提高机体对其他严重损伤的耐受能力，如延缓心肌坏死等[14-15]。其心肌保护作用体现在减少心肌梗死面积和增强心肌细胞存活力[16-17]、抗心律失常[18]、促进心脏功能恢复等[14-15]。我们的前期实验显示，热预处理可以通过调节心脏内源性保护物质分泌、调控心肌凋亡基因表达和预防心肌缺血局部的炎性反应，从而抑制心肌细胞过度凋亡，减轻心肌损伤程度[12]。因此，本实验对热预处理对超负荷训练后PKCδ、PKCε表达变化进行研究，以深入了解热预处理保护运动心脏的分子生物学机制。

PKC是1977年在鼠脑胞质成分中发现的一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶，由多种具有不同生物学特性的同工酶组成。它是一类结构相似、功能不同的丝氨酸/苏氨酸家族，广泛存在于动物的各种组织细胞中。研究证明，PKC是重要的细胞内信号转导分子，介导生物信号从细胞膜向细胞核的传递，构成细胞内重要的信号转导系统，对细胞分化、增殖和凋亡起重要调节作用。

至今已在哺乳动物的组织中确定了12种亚型，根据其结构及特征分成3大类：①传统PKC(conventional PKC,cPKC)，包括PKCα、PKCβ1、PKCβ2和PKCγ，需Ca2+和二脂酰甘油(diacyl glycerol,DAG)同时作用才被激活，因而也称为钙依赖型；②新型PKC (novel PKC,nPKC)，包括PKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ，只需DAG即可被激活；③非典型PKC(atypical PKC,aPKC)，包括PKCζ、PKCλ和PKCι，不依赖于Ca2+和DAG激活，可被磷脂酰丝氨酸、3,4,5-三磷酸肌醇(inositol trisphosphate,IP3)与血管紧张素Ⅱ激

活[19]。

心肌组织中PKC表达存在种属差异性，如成年大鼠心肌中表达8种PKC亚型，成年人心肌中可检测到9种PKC亚型，而在人、兔、豚鼠、大鼠与小鼠心肌中均可以检测到的只有PKCα、PKCδ和PKCε。心肌中表达PKC存在种属差异性的生理学意义尚不清楚，但是，PKCα、PKCδ和PKCε在大部分种属心肌内表达，提示它们可能具有更重要的作用。

静息状态下，PKC主要存在于胞浆中，以钝化形式存在。一般情况下，细胞内的DAG浓度不足以活化PKC；当受到外界信号刺激后，胞外信号通过受体激活磷脂酶C，通过磷脂酶-C和磷脂酶D使膜磷脂分解，产生3,4,5-IP3和DAG；3,4,5-IP3促使Ca2+池中的Ca2+释出，胞浆内Ca2+浓度升高，激活PKC；而DAG可直接激活PKC。PKC被激活后，胞膜上ATP依赖的K离子通道(KATP)开放，K+外流，Ca2+内流减少，动作电位时程缩短，ATP消耗减少，保护心肌细胞[20]。PKC激活后还可引起线粒体钙负荷降低，减轻钙负荷增加所致的心肌细胞凋亡[21]。在以前的研究中，我们曾观察到PKC途径激活后具有保护心脏、增强抗疲劳能力的作用，从而预防心源性疲劳的发生和发展[22]。但这只是对整个PKC家族而言，具体到PKCδ、PKCε这些亚型与运动训练的关系，及预处理对它们的影响

如何目前研究较少。

本实验首先应用免疫组化观察PKCδ和PKCε表达，结果与文献报道[6-10]基本一致：热预处理可抑制超负荷训练后PKCδ表达，而促进PKCε表达。实验结果还显示，PKCδ表达变化幅度大于PKCε表达变化幅度，提示PKCδ对刺激的反应较PKCε更为敏感，在超负荷训练致心肌损伤过程中可能更为重要。Real-time PCR和Western blotting检测结果大体与免疫组化的检测结果相似。表明PKCδ、PKCε的激活与超负荷训练和热预处理这两种外界刺激因素有密切联系。开发以PKCδ为靶点的治疗方案可能是有益的。

本研究在前期研究的基础上进一步证实，在刺激因素作用下，PKCδ和PKCε的激活与PKC整个家族的激活可能不完全一致，PKC家族对外界刺激的反应是各种亚型综合作用的结果。在热预处理发挥心肌保护效应的过程中，PKCδ和PKCε的表达均出现改变，提示它们在这一过程中发挥了重要作用。比较而言，热预处理对PKCδ的影响要大于对PKCε的影响。

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Effects of Heat Preconditioning on Expression of Protein Kinase C in Myocardium of Rats after Overload Exercise

YANG Yi,LI Zhang-hua,SHI Wu-di,LIU Hua,ZHANG Jie.College of Health Science,Wuhan Institute of Physical Education,Wuhan,Hubei 430079, China

Objective To investigate the effects of heat preconditioning(HP)on the expression of protein kinase C(PKC)δ and PKCε in the myocardium of overload exercise rats.Methods 25 male three-month-old Sprague-Dauley rats were divided into control group(n=5), exercise group(n=10)and HP group(n=10).The expression of PKCδ and PKCε in the myocardium was detected with immunohistochemistry,real-time PCR and Western blotting 8 weeks after overload exercise.Results The expression of PKCδ significantly increased in the exercise group compared with the control group and the HP group(P＜0.05).In another hand,PCR and immunohistochemistry showed the expression of PKCε in the exercise group decreased compared with the control group and the HP group(P＜0.05),but it was not significantly different among the groups using Western blotting(P＞0.05).Conclusion PKCs may play an important role in the HP-induced cardio-protection during overload exercise.

heat preconditioning;myocardium;protein kinase C;overload exercise;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.013

R873

A

1006-9771(2015)01-0049-05

2014-07-29

2014-11-26)

1.国家自然科学基金项目(No.30700388)；2.湖北省自然科学基金一般项目(No.2011CDB313)；3.湖北省教育厅科研计划重点项目(No.D20144101)。

1.武汉体育学院健康科学学院，湖北武汉市430079；2.武汉市第三医院，湖北武汉市430060。作者简介：杨翼(1973-)，女，汉族，浙江余姚市人，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：中医药在运动医学领域的应用。