即时高压氧对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积的影响①

李纲，张志强，张立新

即时高压氧对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积的影响①

李纲，张志强，张立新

目的探讨即时高压氧对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积的影响。方法Sprague-Dawly大鼠随机分成对照组(n=9)、高压空气组(n=9)、高压氧组(n=9)、假手术组(n=5)，前三组应用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血模型，高压空气组、高压氧组在高压氧舱内造模，高压氧组于造模后立即行高压氧治疗。各组大鼠均于术后6 h断头取脑，计算各组大鼠脑梗死占脑总体积百分比。结果与对照组相比，高压氧组及高压空气组梗死百分比均显著减少(P＜0.001)，高压氧组减少得更显著(P＜0.001)。结论即时高压氧治疗能够降低大鼠脑局灶性缺血后梗死体积。

脑缺血；即时高压氧；梗死体积；大鼠

[本文著录格式]李纲，张志强，张立新.即时高压氧对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积的影响[J].中国康复理论与实践,2015, 21(1):39-41.

CITED AS:Li G,Zhang ZQ,ZHANG LX.Effect of immediate hyperbaric oxygen on infarct size in rats after focal cerebral ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):39-41.

脑是人体最重要的器官。脑组织质量仅占体质量的2%～3%，但其需氧量却占全身供给量的20%～25%，脑组织中几乎无葡萄糖和氧的储备，对缺血缺氧耐受性极差。脑血管病是目前世界上公认的严重威胁人类健康的疾病之一，发病率高，死亡率高，致残率高。目前认为，溶栓治疗、神经影像及氧疗对患者功能恢复极为重要。若能在脑卒中发病数小时内用先进的神经影像学确定诊断，并及时正确地采取高压氧治疗，可以为溶栓或应用神经保护药物争取时间。早期溶栓治疗非常有效[1]；“神经保护”可以阻断一种或多种缺血细胞死亡途径，从而改善脑卒中的预后。但目前脑卒中药物治疗存在两个致命的弱点：①由于溶栓治疗时间窗较短(3 h)，临床上只有5%左右的脑卒中患者受益；②虽然神经保护药物在动物研究中显示有一定疗效，但目前没有任何一种神经保护药在三期临床研究中取得令人满意的疗效。所以，既能安全地挽救缺血神经元，又能为脑卒中溶栓治疗扩大治疗窗的治疗方案将会有很大应用前景[2]。

Acka[3]等、Li等[4]的研究显示，高压氧治疗可有效减少大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型脑梗死体积。目前氧疗的治疗形式主要有两种：常压氧治疗和高压氧治疗。医用氧(氧浓度21%)的氧分压在1个大气压(atmosphere,ATM,1 ATM=760 mmHg=101.325 kPa)的环境中为102 mmHg，常压氧(氧浓度100%，1 ATM)的氧分压也只能增至673 mmHg，而高压氧(氧浓度100%，3 ATM)

可以使氧分压增至2193 mmHg[5]。Singhal等报道，如果常压氧治疗能在MCAO模型成功后15或30 min内进行，可以显著减少梗死体积[6]。多数研究表明，高压氧及常压氧治疗急性缺血性脑卒中有良好的实验效果，即使高压氧治疗的基本机制仍不十分明确，但高压氧的治疗效果在许多文献中优于常压氧。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

手术过程经中国医科大学伦理委员会审批并且符合动物实验操作规程。雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体质量250～280 g，大鼠饲养于12 h昼夜循环且室温22～25℃的环境中，自由进食及饮水。大鼠称重，按体质量从轻到重编号1～40，应用SPSS 13.0中SYNTAX窗口输入随机分组程序，将40只大鼠分为以下4组：对照组(n=9)、高压空气组(n=9)、高压氧组(n=9)、假手术组(n=5)，其余8只备用。所有大鼠均在MCAO模型制作成功后6 h，麻醉后处死。

1.2 模型制备

10%水合氯醛0.3～0.5 ml/100 g腹腔注射麻醉并保持自主呼吸，如麻醉不足可适当增加药量。大鼠仰卧位固定于操作台上，取颈正中切口，钝性分离下颌下腺，分离暴露右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。在颈内、颈外动脉分叉处靠近颈总动脉根部结扎颈外动脉，并结扎颈总动脉近心端。用微血管夹快速夹闭颈内动脉，在距颈总动脉根部约0.5 cm处用4、5号针头扎一直径约0.35 mm小口，将直径0.286 mm、头部沾有硅胶的鱼线插入小口，打开血管夹，使鱼线进入颈内动脉，当有阻力感时停止进入，进线长度距颈总动脉根部约(18±0.5)mm。将鱼线环状结扎，固定于颈总动脉根部。逐层缝合至皮肤。手术过程用电热毯维持大鼠肛温(37.0±0.5)℃。

1.3 干预方法

1.3.1 高压氧组

应用GY3200型高压氧舱(烟台宏远氧业公司)，参数为升压20 min，稳压(2 ATM)65 min，降压20 min。稳压后吸100%纯氧60 min，中间休息5 min。

大鼠于早8点进入氧舱，于升压过程(20 min)完成造模。将大鼠置于约1 m3的密闭容器中，连通氧气管，容器内温度22～25℃，放入少量碳酸钙以吸收大鼠呼出的二氧化碳。治疗过程及治疗后无大鼠出现癫痫症状。

1.3.2 高压空气组

在同一高压氧舱内造模，参数相同。将大鼠置于另一个1 m3的容器中，将容器顶盖去除。不接氧气管，大鼠呼吸氧舱中的空气。

1.3.3 对照组

大鼠不进入高压氧舱中，于早8点造模，置于1 m3容器中。

1.3.4 假手术组

大鼠不进入高压氧舱中，于早8点手术，步骤同前，只是进线长度为距颈总动脉根部10 mm。术后置于1 m3容器中。

1.4 梗死体积测定

大鼠苏醒后采用Longa评分判断模型是否成功：0分，无神经损伤体征；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，行走时向偏瘫侧转圈；3分，行走时向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。0分及4分剔除。

术后6 h再次麻醉大鼠，断头取脑。脑组织迅速放入-20℃冰箱内冷冻15 min，冠状切片，厚2 mm。第1刀在脑前极与视交叉连线中点处；第2刀在视交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄与后叶尾极之间。切片置0.2 mmol/L PBS配成的1%2,3, 5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)中，锡箔纸盖住后，放入恒温水浴箱，37℃20 min，翻动脑片，使其与染色液均匀接触。切片取出，置0.1 mol/L PBS配成4%多聚甲醛中固定，24 h后用数码相机拍照，OSIRIS图像处理软件计算梗死体积占全脑的百分比。

1.5 统计学分析

用SPSS 13.0统计软件对数据进行正态性检验，方差齐，采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

动物麻醉意外死亡1只，造模失败3只，均用备用大鼠补足。备用大鼠仍用SPSS 13.0中SYNTAX窗口输入随机程序分组。纳入统计32只。假手术组未见梗死灶，不对该组数据进行统计分析。

高压空气组及高压氧组梗死体积比均显著小于对照组(P＜0.001)，高压氧组显著小于高压空气组(P＜0.001)。

表1 各组大鼠脑梗死体积比(%)

3 讨论

脑卒中后，细胞损伤途径主要有4种：兴奋性中毒、氧/一氧化氮超载、炎性反应和细胞凋亡[7]。缺氧是造成上述问题的重要原因，增加体内氧气水平理论上可以对缺血组织起保护作用。

早期认为，高压氧可以提高血浆内游离氧浓度达数十倍，从而促进氧分子扩散至缺血组织，减少对血红素结合氧的依赖。近年报道，高压氧可以通过生化、分子及血流动力学途径产生作用。脑缺血缺氧时，ATP生成减少，谷氨酸盐释放，钙离子超载，氧自由基过度产生和炎症反应造成线粒体损伤。以上病理反应造成了神经细胞凋亡，引起脑水肿和血脑屏障功能减退，最终造成患者死亡或者遗留功能障碍。

Zhang等研究表明，高压氧能保护血脑屏障，减轻脑水肿；使体内谷氨酸盐、葡萄糖及丙酮酸盐相对稳定；能抑制炎症反应和细胞凋亡；反调节超氧化物歧化酶；增强促进细胞存活基因Bcl-2表达；增加红细胞变形能力改善微循环减轻缺血-缺氧状态[8]。Cheng等发现，高压氧可以减少脑卒中大鼠模型环氧化酶-2 mRNA和蛋白质水平，减少中性粒细胞侵润，从而抑制炎性反应[9]。还有研究显示，在缺血再灌注模型中，高压氧可减少多种凋亡基因表达，如诱导因子-1α、P54、caspase-9及caspase-3。这些抑制炎症反应和抗细胞凋亡的效应可以促进神经细胞恢复。

本研究显示，脑缺血后即刻予高压氧治疗，可以减少脑梗死体积。值得一提的是，即刻予高压空气治疗亦能减少梗死体积，只不过效果较差。

由于梗死体积的测定依赖图像处理软件，因此在计算过程中难免造成误差。本实验通过同一图像多次测量取平均值的方法得出最后梗死体积；拍摄时用同一相机、相同参数、固定拍摄距离及选择自然光相似的条件时间点进行拍摄，尽量减少误差。但并不能完全避免误差的产生。

本研究选取的高压氧介入时间极早，在临床上很难实现，只能供临床选择高压氧介入时机时借鉴。今后应选取多个时间点介入高压氧，并观察多种指标，为临床工作提供更多依据。

国内外高压氧治疗脑缺血的具体方案有很大不同，高压氧介入时机、高压氧治疗疗程、高压氧治疗剂量等，文献报道尚无统一意见。本文选取即时高压氧作为干预因素，国内外鲜有报道，可以完善高压氧介入时机方面相关研究。

[1]GriessenauerCJ,Foreman P,Deveikis JP,et al.Endovascular tools available for the treatment of cerebrovascular disease[J]. Neuro Clin NAm,2014,25(3):387-394.

[2]Singhal AB.A review oxygen therapy in ischemic stroke[J]. Neurol Res,2007,29(2):173-183.

[3]Acka G,Sen A,Canakci Z,et al.Effect of combined therapy with hyperbaric oxygen an antioxidant on infarct volume after permanent focal cerebral ischemia[J].Physiol Res,2007,56 (3):369-373.

[4]Li Z,Liu W,Kang Z,et al.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model[J]. Brain Res,2008,27(1196):151-156.

[5]Jain KK.Physical,physiological and biochemical aspects of hyperbaric oxygen[M]//Jain KK.Textbook of Hyperbaric Medicne.Gottingen:Hogrefe&Huber,2004:10-20.

[6]Singhal AB,Dijkhuizen RM,Rosen BR,et al.Normobaric hyperoxia reduces MRI diffusion abnormalities and infarct size in experimental stroke[J].Neurology,2002,58(6):945-952.

[7]Lo EH,Dalkara L,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci,2003,4(5): 399-415.

[8]Zhang JH,Lo T,Mychaskiw G,et al.Mechanisms of hyperbaric oxygen and neuroprotection in stroke in adult rats[J].Pathophysiology,2005,12(1):63-77.

[9]Cheng O,Ostrowski RP,Wu B,et al.Cyclooxygenase-2 mediates hyperbaric oxygen preconditioning in the rat model of transient global cerebral ischemia[J].Stroke,2011,42(2):484-490.

Effect of Immediate Hyperbaric Oxygen on Infarct Size in Rats after Focal Cerebral Ischemia

LI Gang,ZHANG Zhi-qiang,ZHANG Li-xin.Department of Rehabilitation,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang,Liaoning 110000,China

Objective To investigate the effect of immediate hyperbaric oxygen on focal cerebral ischemia of rats.Methods Sprague-Dawly rats were randomly divided into control group(n=9),hyperbaric air group(n=9),hyperbaric oxygen group(n=9)and sham group(n=5).The middle cerebral arteries were occluded in the former 3 groups,while the hyperbaric air group and the hyperbaric oxygen group operated in the hyperbaric chamber,and the hyperbaric oxygen group accepted hyperbaric oxygen immediately after operation.All the rats were sacrificed 6 hours after operation and the percentage of volume of infarction in the brain slices was calculated.Results The percentage of infarction decreased in both hyperbaric oxygen group and hyperbaric air group compared with the control group(P＜0.001),and decreased more in the hyperbaric oxygen therapy than in the hyperbaric air group(P＜0.001).Conclusion Immediate hyperbaric oxygen therapy can reduce infarct size in rats after focal cerebral ischemia.

cerebral ischemia;immediate hyperbaric oxygen;infarct size;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.010

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0039-03

2014-08-25

2014-09-16)

中国医科大学附属盛京医院康复中心，辽宁沈阳市110000。作者简介：李纲(1985-)，男，辽宁沈阳市人，硕士，医师，主要研究方向：高压氧与脑血管病。通讯作者：张志强。E-mail:zhangzq@sj-hospital.org。