HPLC法测定莲子壳提取物中原花青素的含量

童锡迪，彭 红*，王 琼，金 鑫

（江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004）

HPLC法测定莲子壳提取物中原花青素的含量

童锡迪，彭 红*，王 琼，金 鑫

（江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004）

目的：建立测定莲子壳提取物中原花青素含量的高效液相色谱法。方法：色谱柱Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-水-甲酸-异丙醇（13∶73∶8∶6，V/V）；检测波长525 nm；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL。结果：原花青素在37.6～300.8 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 5，加样回收率为99.2%，相对标准偏差为0.30%。结论：该方法简便、快速、准确，具有良好的重复性和回收率，可作为莲子壳提取物中原花青素含量的测定方法。

莲子壳提取物；原花青素；高效液相色谱法

原花青素是不同数量的黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇聚合而成的聚合物的总称[1]，因其具有良好的抗氧化、清除自由基、抑制肿瘤、抗诱变等生物活性[2-18]，现已被广泛用于医药、保健品、食品及化妆品等领域。莲子壳为睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥成熟种子的果皮，莲子壳作为莲的副产物，资源十分丰富，但在加工过程中，多数莲子壳被丢弃，资源未被充分利用，本研究发现，莲子壳中含有原花青素，故以莲子壳为原料提取原花青素，属于废物再利用。原花青素是一类多酚类化合物，化学成分复杂，其含量测定目前国际上并无统一的方法，常用的含量测定方法有铁盐催化比色法、香草醛法、紫外分光光度法等[19-25]。香 草醛法测定的是原花青素单体及其多聚体的总量，重复性较差；紫外分光光度法因其干扰性物质较多，只适用于原花青素纯度特别高的产品；铁盐催化比色法操作简便，对原花青素测定专一性较好；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定相对准确。未见HPLC法测定莲子壳提取物中原花青素含量的相关报道，本研究将铁盐催化比色法与HPLC法结合，测定莲子壳提取物中原花青素的含量，该方法简便可行，具有良好的重复性，可为莲子壳资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲子壳由广昌县白莲科学研究所提供，品种：赣莲62、太空莲32、白花莲；莲子壳提取物（批号20130606、20130608、20130610） 自制；莲子壳提取物（批号20130702、20130705、20130708） 江西远健药业有限公司；原花青素对照品（纯度＞95%） 贵州迪大科技责任有限公司；甲醇、甲酸、异丙醇（均为色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；水为自制三蒸水；其余试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

1200系列高效液相色谱仪（配有四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器）；BS214D电子天平 北京赛多利斯电子仪器有限公司；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司；SZ-97自动三重纯水蒸馏器 上海雅荣生化仪器设备有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水-甲酸-异丙醇（13∶73∶8∶6，V/V）；检测波长525 nm；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL。

1.3.2 莲子壳提取物的制备

以原花青素的提取转移率为指标，铁盐催化后以HPLC法为检测手段，采用单因素试验和正交试验法对乙醇体积分数、溶剂倍数、提取温度、提取时间进行考察，优选提取工艺条件，确定莲子壳提取物的最佳提取工艺为乙醇体积分数50%、溶剂倍数8 mL/g、提取温度65 ℃、提取2 次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，真空干燥，即得莲子壳提取物。莲子壳提取物的得率约为10.1%，在最佳提取工艺条件下，提取物中原花青素的提取转移率约为88.3%。

1.3.3 测定原理

莲子壳提取物中的原花青素能在热酸性条件下醇解产生花色素，利用花色素的还原性在铁盐的催化反应条件下产生特征性的红色，并且在可见光区有一特征吸收峰，最大吸收峰波长为525 nm，其显色灵敏而稳定。

1.3.4 水解反应

本研究在李华等[26]研究的基础上，对水解反应条件进行优化，最终确定的水解反应条件如下。将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比混合后，取出15 mL置于具塞锥形瓶中，再加入0.5 mL硫酸铁铵溶液（质量分数2%硫酸铁铵溶液：称取硫酸铁铵2 g，用浓度为2 mol/L盐酸溶解，定容至100 mL）和2 mL试样溶液，混匀，称定质量，置沸水浴中回流，精确加热40 min后，立即置冰水中冷却，用甲醇补足损失的质量，经0.45 μm滤膜过滤，待进HPLC分析。

1.3.5 溶液的制备

1.3.5.1 对照品溶液的制备

取原花青素对照品约15 mg，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得对照品储备液。分别精密量取对照品储备液各0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，按1.3.4节进行实验，得到各级标准溶液（37.5、75、150、225、300 μg/mL）。含量测定对照品溶液的质量浓度约为150 μg/mL。

1.3.5.2 供试品溶液的制备

取莲子壳提取物约60 mg，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声20 min，再加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，按1.3.4节进行实验，即得供试品溶液。

1.3.5.3 阴性对照溶液的制备

用甲醇作为试样溶液，按1.3.4节进行实验，即得阴性对照溶液。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

取各级标准溶液（37.5、75、150、225、300 μg/mL），按1.3.1节色谱条件进样分析，以对照品溶液的质量浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，进行回归分析。回归方程为Y=1.547 4X—17.023，r=0.999 5。结果表明，原花青素在37.6～300.8 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 专属性实验

图 1 原花青素对照品（A）、莲子壳提取物（B）、阴性对照（C）色谱图Fig.1 Chromatograms of proanthocyanidins reference substance (A), lotus seed shell extract (B), and negative control (C)

精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，分别进样10 μL，按1.3.1节色谱条件测定，结果供试品溶液中原花青素分离度较好，阴性对照溶液在对应位置上未见相同色谱峰，表明阴性对照无干扰，见图1。

2.3 精密度实验

取原花青素对照品溶液，重复进样6 次，记录其峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.37%，结果表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性实验

取同一供试品溶液，分别于配制后0、15、30、45、60、90 min进样测定，记录其峰面积，计算RSD为0.35%（n=6），结果表明供试品溶液在90 min内显色基本稳定。

2.5 重复性实验

取莲子壳提取物（20130705）6 份，按1.3.5.2节方法制备供试品溶液，按1.3.1节色谱条件进行测定，其平均含量为43.0%，RSD为1.52%。说明含量测定方法重复性良好。

2.6 加样回收率实验

分别取已知含量的莲子壳提取物6 份，各约30 mg，精密称定，分别精密加入相当于样品中原花青素含量80%、100%、120%的原花青素对照品，精密称定，按1.3.5.2节方法制备供试品溶液，按1.3.1节色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。

表 1 加样回收率实验（n=9）Table 1 Results of recovery tests (n=9)

2.7 灵敏度实验

取莲子壳提取物适量，按1.3.5.2节方法制备供试品溶液，并逐级稀释，按1.3.1节色谱条件进行测定，信噪比约为10时，样品溶液的质量浓度50.5 μg/mL；信噪比约为3时，样品溶液的质量浓度16.6 μg/mL，即莲子壳提取物中原花青素的定量限50.5 μg/mL，检出限16.6 μg/mL。

2.8 样品含量测定

应用本研究建立的方法对6 批不同批号的莲子壳提取物中的原花青素含量进行测定，结果见表2。

表 2 6 批样品中原花青素的含量Table 2 Proanthocyanidins contents in samples from six different batches

3 讨 论

本研究考察10、20、30、40 min不同超声时间对样品提取效果的影响，最终确定超声提取20 min。在流动相的选择中，分别考察了甲醇-水、甲醇-水-甲酸、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-甲酸-异丙醇等体系，最 终确定甲醇-水-甲酸-异丙醇（13∶73∶8∶6，V/V）为流动相。

本研究也尝试采用紫外分光光度法测定莲子壳提取物中原花青素的含量，测得提取物中原花青素的含量约为48%，与HPLC法相比，测定结果稍微偏大，原因可能是部分反应产物对原花青素的测定存在一定的干扰，鉴于HPLC法的专属性较好，因此选择HPLC法进行莲子壳提取物中原花青素的含量测定。

本研究中稳定性实验的时间短，原因可能是反应生成的物质不稳定等，故笔者建议莲子壳提取物中原花青素的含量测定在90 min内进行。

本研究尝试采用AB-18、ADS-8、D101等型号大孔吸附树脂纯化莲子壳提取物，经HPLC法测定，原花青素含量达到89%，故可继续探索分离纯化条件，提高莲子壳提取物中原花青素的纯度，为莲子壳提取物的实际应用提供相应的参考依据。

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Determination of Proanthocyanidins in Lotus Seed Shell Extract by HPLC

TONG Xidi, PENG Hong*, WANG Qiong, JIN Xin
(School of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China)

Objective: To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of proanthocyanidins in lotus seed shell extract. Methods: HPLC analysis was carried out using Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm), and the mobile phase consisted of methanol-water-formic acid-isopropyl alcohol (13:73:8:6, V/V) at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 525 nm, the column temperature was set at 35 ℃, and the injection volume was 10 μL. Results: A good linearity of proanthocyanidins was achieved in the range of 37.6-300.8 μg/mL (r = 0.999 5). The average recovery was 99.2%, with relative standard deviation (RSD) of 0.30%. Conclusion: This method is simple, reproducible, accurate and reliable and thus can be used for quality control of lotus see shell extract.

lotus seed shell extract; proanthocyandins; high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.7

A

1002-6630（2015）02-0145-04

10.7506/spkx1002-6630-201502028

2014-06-24

童锡迪（1988—），女，硕士研究生，研究方向为药物质量控制。E-mail：812648316@qq.com

*通信作者：彭红（1964—），女，教授，学士，研究方向为药物质量控制。E-mail：ibbmm@163.com