局灶性脑缺血损伤后低氧诱导因子1α促神经元凋亡的作用机制

汪卫东，张洪峰(综述)，王　乐，王朝宗(审校)

(邯郸市中心医院药学部，河北 邯郸 056001)



局灶性脑缺血损伤后低氧诱导因子1α促神经元凋亡的作用机制

汪卫东，张洪峰(综述)，王乐，王朝宗※(审校)

(邯郸市中心医院药学部，河北 邯郸 056001)

摘要：大脑是对缺氧非常敏感的器官，氧浓度降低可以诱导低氧诱导因子1α(HIF-1α)的快速大量表达，尤其在缺血半暗带，及时挽救该部位的神经元是减轻缺血性损伤的关键。HIF-1α是一种核转录因子，能够诱导胱天蛋白酶、p53、诱导型一氧化氮合酶、Bcl-2等促凋亡基因的转录表达、促进氧自由基的产生以及影响血脑屏障的通透性。近年来，许多研究阐述了HIF-1α在局灶性脑缺血损伤的病理生理机制中，尤其是促神经元凋亡方面，扮演着非常重要的角色。

关键词：局灶性脑缺血；低氧诱导因子1α；神经元；凋亡

局灶性脑缺血是目前致残甚至致死的主要疾病之一。局灶性脑缺血发生后，在梗死灶周围会形成“缺血半暗带”，该部位神经元处于可逆的损伤状态，及时挽救该部分神经元是减轻缺血性损伤的关键。大脑是对缺氧非常敏感的器官，氧浓度降低可以诱导低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的快速大量表达，尤其在缺血半暗带。现对局灶性脑缺血损伤后HIF-1α促神经元凋亡的作用机制予以综述。

1HIF-1α稳定性的调节

HIF-1α是Goldberg等[1]在1988年于人的肝脏瘤细胞中发现的，它主要在胞质表达且与氧的浓度密切相关。在常氧状态下，HIF-1α通过脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase,PHDs)-肿瘤抑制基因-蛋白酶体途径迅速降解，使其含量非常低。然而PHDs活性是O2依赖性的，低氧(<5%)时其活性将被抑制[2]，进而阻断PHDs-肿瘤抑制基因-蛋白酶体降解途径，致使低氧状态下HIF-1α水平迅速升高。稳定的HIF-1α将被转移到细胞核与HIF-1β构成二聚体，即异源二聚体转录因子HIF-1[3]。HIF-1α与辅激活蛋白p300/反应结合蛋白结合后，通过与目的基因上的缺氧反应原件 (缺氧反应元件:碱基序列为5′-CGTG-3′)结合诱导其转录表达[3-4]。

2HIF-1α的目的基因与促神经元凋亡作用

Helton等[5]研究发现，在剔除HIF-1α基因的急性脑缺血动物模型中，多种促神经元凋亡基因表达下调，提示脑缺血发生后上调表达的HIF-1α能够促进神经元细胞的死亡。细胞的死亡有两种方式：凋亡和坏死，取决于脑损伤的严重程度[6]。在病情较轻的局灶性脑缺血损伤中或者缺血病死灶周围，凋亡是神经元细胞死亡的主要途径。细胞凋亡(又称程序性细胞死亡)是用来描述通过一般途径诱导细胞生理性死亡这一过程的术语，它在整个生长发育过程中持续存在，以清除病态细胞。局灶性脑缺血发生后，HIF-1α通过诱导多种促凋亡基因的转录表达，参与神经元细胞的凋亡过程。这些基因各自编码具有与凋亡有关的蛋白，包括胱天蛋白酶(caspases)、p53、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric synthase，iNOS)、Bcl-2蛋白家族成员等。

2.1HIF-1α与caspase caspase-3、-8、-9和-10是一组半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中发挥着主要的作用。HIF-1α与caspase启动子结合，直接诱导caspase表达上调，这个过程与p53有关。caspase以具有内在活性的蛋白酶原的形式被合成，然后在自身催化的作用下，经过特定的蛋白水解分裂被激活。其中，活化的caspase-3能够通过破坏细胞骨架蛋白而导致DNA断裂。所以，caspase-3是细胞凋亡的中心“刽子手”，并作为检测细胞凋亡的标志[7]。目前，普遍认为caspase通过两条途径参与细胞凋亡过程：内在途径和外在途径。caspase(尤其是caspase-9)与Bcl-2蛋白家族相互作用导致存储在线粒体内膜空间的促凋亡蛋白释放，进而引起细胞凋亡，称为“内在途经”。而“外在途径”是“死亡受体”途径，它有许多生理功能，包括促进细胞凋亡。例如，Fas就是一种“死亡受体”[8]。此外，caspase-8是细胞凋亡“外在途径”的引发者；Bid是“内在途经”和“外在途径”之间的“沟通员”。Bid属于Bcl-2蛋白家族成员，被caspase-8激活后，在线粒体中通过与其他Bcl-2蛋白家族成员结合参与调节细胞凋亡[9]。

2.2HIF-1α与p53p53是一种肿瘤抑制蛋白，它的生命周期较短(10～30 min)，在大多数细胞(包括神经元)中以较低水平持续表达。Chen等[10]通过体内实验结果表明，低氧时HIF-1α通过抑制p53泛素化阻滞其降解，并且阻断p53转运，导致与p53相关的促凋亡基因的表达上调。

p53是一种非常重要的神经元细胞凋亡诱导因子，通过诱导目的基因转录表达引发细胞凋亡，这些基因编码促凋亡蛋白包括p53、p53凋亡调控因子、Noxa等。p53与鼠/人双微基因2的结合是诱导p53快速降解过程中非常关键的一步[11]，与鼠/人双微基因2结合将p53从细胞核中转移到细胞质，然后在蛋白酶体的作用下被泛素化和降解。但是低氧时，在HIF-1α的作用下，p53将会被磷酸化或者乙酰化，稳定性提高。稳定的p53激活多种促凋亡蛋白的表达，包括Bax、p53凋亡调控因子、Noxa、Bid等。Bax属于Bcl-2蛋白家族成员，它也是很重要的细胞凋亡调节因子。Niizuma等[12]认为，Bax是神经元细胞中最重要的促凋亡蛋白，说明p53在细胞凋亡过程调节中的重要性。Bax随着线粒体膜的破坏进入线粒体，使细胞色素C从线粒体内膜空间释放，最终致使caspase-9和caspase-3活化。但是，p53会与HIF-1α竞争性地结合p300/反应结合蛋白，使HIF-1α的诱导功能受到一定的抑制。

2.3HIF-1α与Bcl-2蛋白家族Bcl-2蛋白家族包括至少20多种促凋亡或者抗凋亡的蛋白成员，它们在细胞凋亡过程中发挥着很重要的调节作用。Bcl是一类抗凋亡蛋白，而Bax是一种促凋亡蛋白，它们都属于Bcl-2家族。Galluzzi等[13]研究发现，在神经元细胞中，凋亡信号的产生能够被死亡抑制因子所抑制，如Bcl-2蛋白。前面已提到，Bax是诱导神经元细胞凋亡最重要的因子。然而，Bcl-2蛋白能够通过干扰Bax向线粒体的转移而阻止促凋亡蛋白的释放。而且，表达增多的Bcl-2还能够保护线粒体膜的通透性不被破坏。所以，局灶性脑缺血发生后，维持Bcl-2/Bax平衡对神经元的存活非常重要。

BNIP3(含BH3区的Bcl-2家族促凋亡成员)是Bcl-2家族中另一种促凋亡蛋白，在局灶性脑缺血发生时被诱导表达并受HIF-1α调节。虽然HIF-1α调节BNIP3表达的作用机制仍不完全清楚，但是Althaus等[14]通过体内研究发现，BNIP3转录启动子中含有能与HIF-1α结合的HRE结构。与Bax不同的是，BNIP3诱导细胞凋亡是不依赖caspase的。BNIP3能结合并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x活性，如此会导致线粒体功能障碍，如线粒体膜通透孔的异常开放[15]。

2.4HIF-1α与iNOS哺乳动物体内的一氧化氮合酶(NOS)可以分成3种亚型：神经元型NOS、内皮型NOS和iNOS。其中局灶性脑缺血发生后，iNOS能被HIF-1α直接诱导产生，它在缺血性损伤区域会诱发炎症[16]。然而，由iNOS催化产生的一氧化氮(NO)有抑制iNOS降低梗死面积的作用。而且过量的NO也会影响细胞色素氧化酶的活性，抑制线粒体呼吸作用，进而导致神经元凋亡[17]。

3HIF-1α与活性氧自由基致神经元凋亡作用

在局灶性脑缺血损伤中，尤其是再灌注后，活性氧类(reactive oxygen free radicals，ROS)在线粒体中过度产生。过剩的ROS将会破坏生物大分子，包括蛋白质氧化、DNA氧化和脂质过氧化，导致细胞凋亡[18]。在线粒体呼吸过程中，ROS产生于复合物Ⅰ和Ⅲ。NADPH氧化酶家族(Nox)在ROS的产生过程中也发挥着重要作用[19]。HIF-1α通过上调Nox2的表达和抑制复合物Ⅰ的活性，促进ROS的大量产生。然而，对这一调节机制的了解仍不确切，需要进一步研究。ROS的增多也有利于HIF-1α的稳定和活化：ROS能够抑制HIF-1α的泛素化，并且降低PHDs的活性，进而抑制HIF-1α的降解，致使HIF-1α水平升高[20]；而且有研究表明，ROS能够通过复杂的信号传递网络，诱导HIF-1α活化。ROS在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的催化作用下生成过氧化物，进而在谷胱甘肽过氧化物酶或者过氧化氢酶催化作用下生成水和氧[21]。SOD是体内ROS最重要的清除因子，与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶共同构成了ROS清理系统。SOD有3种亚型：Cu/Zn-SOD(SOD1)、Mn-SOD(SOD2)和细胞外SOD(SOD3)。SOD1和SOD2通过清除ROS而影响HIF-1α的表达水平[20,22]。但表达上调的HIF-1α是否影响SOD的表达，至今仍没有确切的结论。

4HIF-1α与血脑屏障通透性改变致神经元凋亡的作用

血脑屏障(blood brain barrier，BBB)由无孔的微血管内皮细胞构成，它作为一个防御屏障，维持脑的内环境平衡。脑缺血损伤将会导致BBB结构和功能的改变，包括增加BBB通透性，继而出现脑组织水肿加重和出血以及神经元细胞死亡。局灶性脑缺血发生后，稳定的HIF-1α通过诱导目的基因的转录表达参与BBB调节，如血管内皮生长因子。Sivakumar等[23]研究发现，在缺血严重的脑组织中，HIF-1α诱导上调表达的血管内皮生长因子对周围血管系统有益，但是会损伤BBB并改变BBB的通透性。另外，还存在一些不依赖HIF-1α的，但与BBB有关的调节因子，如白细胞在血管中聚集并浸润和星形胶质细胞收缩胞质丝，均能导致BBB通透性增加[24]。

5小结

HIF-1α在局灶性脑缺血损伤的调节中发挥着中心枢纽的作用，许多因素参与HIF-1α表达的调节，HIF-1α也通过激活目的基因诱导多种蛋白的表达。在过去的20年中，对局灶性缺血性脑损后HIF-1α诱导神经元凋亡的分子机制有了更加清晰的认识。但是，要阐明HIF-1α的调节机制仍然需要许多细节的研究，如HIF-1α表达及稳定性的调节机制、HIF-1α和神经元细胞坏死之间的关系、HIF-1α与ROS以及HIF-1α与SOD的相互作用机制仍有待于进一步研究等。这些问题的解决可能为研究、开发防治局灶性脑缺血损伤的有效药物提供新的思路。

参考文献

[1]Goldberg MA,Dunning SP,Bunn HF.Regulation of the erythropoietin gene:evidence that the oxygen sensor is a heme protein[J].Science,1988,242(4884):1412-1415.

[2]Simon MC.Mitochondrial reactive oxygen species are required for hypoxic HIF alpha stabilization[J].Adv Exp Med Biol,2006,588:165-170.

[3]Mimeault M,Batra SK.Hypoxia-inducing factors as master regulators of stemness properties and altered metabolism ofcancer- and metastasis-initiating cells[J].J Cell Mol Med, 2013,17(1):30-54.

[4]Harris AL.Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth [J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):38-47.

[5]Helton R,Cui J,Scheel JR,etal.Brain-specific knock-out of hypoxia-inducible factor-1alpha reduces rather than increases hypoxic-ischemic damage[J].J Neurosci,2005, 25(16):4099-4107.

[6]Chen W,Ostrowski RP,Obenaus A,etal.Prodeath or prosurvival:two facets of hypoxia inducible factor-1 in perinatal brain injury[J].Exp Neurol,2009,216(1):7-15.

[7]Mao M,Hua Y,Jiang X,etal.Expression of tumor necrosis factor α and neuronal apoptosis in the developing rat brain after neonatal stroke[J].Neurosci Lett,2006,403(3): 227-232.

[8]Jin K,Graham SH,Mao X,etal.Fas(CD95) may mediate delayed cell death in hippocampal CA1 sector after global cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21(12):1411-1421.

[9]Grohm J,Plesnila N,Culmsee C.Bid mediates fission, membrane permeabilization and peri-nuclear accumulation of mitochondria as a prerequisite for oxidative neuronal cell death[J].Brain Behav Immun,2010,24(5):831-838.

[10]Chen D,Li M,Luo J,etal.Direct interactions between HIF-1 alpha and Mdm2 modulate p53 function[J].J Biol Chem, 2003,278(16):13595-13598.

[11]Michael D,Oren M.The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system[J].Semin Cancer Biol,2003,13(1):49-58.

[12]Niizuma K,Yoshioka H,Chen H,etal.Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia[J].Biochim Biophys Acta,2010,1802(1):92-99.

[13]Galluzzi L,Blomgren K,Kroemer G.Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury[J].Nat Rev Neurosci, 2009,10(7):481-494.

[14]Althaus J,Bernaudin M,Petit E,etal.Expression of the gene encoding the pro-apoptotic BNIP3 protein and stimulation of hypoxiainducible factor-1alpha (HIF-1alpha) protein following focal cerebral ischemia in rats[J].Neurochem Int,2006,48(8):687-695.

[15]Dhingra R,Gang H,Wang Y,etal.Bidirectional regulation of nuclear factor-κB and mammalian target of rapamycin signaling functionally links Bnip3 gene repression and cell survival of ventricular myocytes[J].Circ Heart Fail,2013,6(2):335-343.

[16]Mi Z,Rapisarda A,Taylor L,etal.Synergystic induction of HIF-1alpha transcriptional activity by hypoxia and lipopolysaccharide in macrophages[J].Cell Cycle,2008,7(2): 232-241.

[17]Lin C,Wu CJ,Wei IH,etal.Chronic treadmill running protects hippocampal neurons from hypobaric hypoxia-induced apoptosis in rats[J].Neuroscience,2013,231:216-224.

[18]Sanderson TH,Reynolds CA,Kumar R,etal.Molecular mechanisms of ischemia-reperfusion injury in brain:pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species generation[J].Mol Neurobiol,2013,47(1): 9-23.

[19]Peng YJ,Nanduri J,Yuan G,etal.NADPH oxidase is required for the sensory plasticity of the carotid body by chronic intermittent hypoxia[J].J Neurosci,2009,29(15):4903-4910.

[20]Sasabe E,Yang Z,Ohno SJ,etal.Reactive oxygen species produced by the knockdown of manganese-superoxide dismutase up-regulate hypoxia- inducible factor-1α expression in oral squamous cell carcinoma cells[J].Free Radic Biol Med, 2010,48(10):1321-1329.

[21]Samarghandian S,BORji A,Delkhosh MB,etal.Safranal treatment improves hyperglycemia,hyperlipidemia and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats[J].J Pharm Sci,2013,16(2):352-362.

[22]Du GJ,Han G,Zhang S,etal.Baicalin suppresses lung carcinoma and lung metastasis by SOD mimic and HIF-1α inhibition[J].Eur J Pharmacol,2010,630(1/3):121-130.

[23]Sivakumar V,Lu J,Ling EA,etal.Vascular endothelial growth factor and nitric oxide production in response to hypoxia in the choroid plexus in neonatal brain[J].Brain Pathol,2008,18(1):71-85.

[24]Mani N,Khaibullina A,Krum JM,etal.Astrocyte growth effects of vascular endothelial growth factor(VEGF) application to perinatal neocortical explants:receptormediation and signal transduction pathways[J].Exp Neurol,2005,192(2):394-406.

Study on the Mechanism of Hypoxia-Inducible Factor-1α in Promoting Neuron Apoptosis after Focal Cerebral Ischemic Injury

WANGWei-dong,ZHANGHong-feng,WANGLe,WANGChao-zong.

(DepartmentofPharmacology,HandanCentralHospital,Handan056001,China)

Abstract：The brain is very sensitive to hypoxia, the lower concentration of oxygen would induce massive and rapid expression of hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α),especially in the ischemic penumbra.While saving the neuron in ischemic penumbra timely is the key to reduce ischemic injury.HIF-1α is a kind of nuclear transcription factor that can induce the transcription of caspases,p53,inducible nitric oxide synthase,Bcl-2 and other pro-apoptotic genes,and promote generation of oxygen free radicals and affect the permeability of blood-brain barrier.In recent years,many studies have illustrated that HIF-1α plays a pivotal role in the pathophysiological mechanism of focal cerebral ischemia injury,especially in promoting the injured neuron apoptosis.Here is to make a review of the pro-apoptosis mechanism of HIF-1α after focal cerebral ischemic injury.

Key words：Cerebral ischemia; Hypoxia-inducible factor-1α; Neuron; Apoptosis

收稿日期：2013-12-25修回日期：2014-05-20编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.01.010

中图分类号：743.3

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)01-0025-03