干细胞治疗卵巢早衰的进展

刘 雪，佳那提·秋瓦西，李朝曦，刘沐芸，胡 祥(综述)，苏放明※(审校)

(1.深圳市北科生物科技有限公司，广东 深圳 518057； 2.深圳市人民医院妇产科，广东 深圳 518020)



干细胞治疗卵巢早衰的进展

刘 雪1，佳那提·秋瓦西1，李朝曦2，刘沐芸1，胡 祥1(综述)，苏放明2※(审校)

(1.深圳市北科生物科技有限公司，广东 深圳 518057； 2.深圳市人民医院妇产科，广东 深圳 518020)

卵巢早衰已成为当今妇女不孕症的主要病因之一，且近年来发病率呈逐年上升的趋势，严重影响患者生活质量、增加社会经济负担。其病因及发病机制较为复杂，尚不十分清楚。目前主要采用激素替代治疗等方法来控制疾病进展，暂无根治方法。干细胞移植是近年来的研究热点之一，成为治疗卵巢早衰的新方法。该文通过回顾干细胞治疗不同病因导致卵巢早衰的临床前研究资料，对可能的治疗机制予以综述，希望为后续研究提供参考。

卵巢早衰；干细胞；修复

卵巢早衰是指女性在40周岁以前，除妊娠外，由某种原因导致的闭经，以血清雌激素水平下降、促性腺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平升高为特征的疾病。目前被广为接受的临床诊断标准为：女性40周岁以前出现至少4个月的闭经，卵泡期血清检测2次或以上(2次检查间隔不少于1个月)均提示血清FSH水平>40 U/L，常伴有雌二醇<73.2 pmol/L[1]。据流行病学统计提示，女性40岁以前的发病率为1%，30岁以前的发病率为1‰；原发性闭经中卵巢早衰占10%～28%，继发性闭经中卵巢早衰占4%～18%，且发病率呈逐年上升的趋势[2]，目前尚无特效的治疗手段。近年来间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治疗成为临床研究的热点，为卵巢早衰的临床治疗提供了新的希望，并取得了初步的疗效。现就干细胞治疗卵巢早衰的研究进展予以综述。

1 卵巢早衰的病因及主要治疗方法

卵巢早衰病因学较为复杂，目前尚未完全清楚，已知的病因主要包括：遗传学因素(如脆性X染色体等)、免疫因素、感染因素、医源性因素(如：化疗、放疗、免疫抑制剂的使用及手术治疗等)、FSH及受体缺陷等。近来的研究表明，细胞免疫在一部分卵巢早衰的发病机制中起到至关重要的作用；研究发现，卵巢早衰患者表现出不同程度的卵巢炎，例如卵巢中T淋巴细胞大量浸润，同时伴有自然杀伤细胞、巨噬细胞和浆细胞的浸润[3]。目前卵巢早衰的治疗措施主要包括心理治疗、中医治疗和西医治疗，其中西医治疗中常用雌孕激素替代疗法、促排卵治疗、免疫治疗及卵巢移植，这些治疗方法虽然对卵巢早衰的临床症状具有一定的缓解作用，但尚无法从根本上修复受损的卵巢功能。激素替代治疗可以人为地通过激素类药物提高患者血清激素水平，但仍无法恢复其生育功能，甚至可能还存在增加乳腺癌等恶性肿瘤的患病风险。现在通过干细胞移植生成有功能的卵母细胞和卵泡细胞，有望从根本上解决这一难题。

2 干细胞治疗的可行性

干细胞是一类早期未分化细胞，具有自我更新、自我复制、无限增殖及多向分化潜能等特点，从来源角度可分为成体干细胞和胚胎干细胞[4]。胚胎干细胞研究存在来源较少、伦理争议大、存在致瘤性及免疫排斥风险等问题，使其临床应用受到较大限制。成体干细胞广泛存在于人体全身组织，易分离培养、扩增，免疫原性低，具有强大的迁移、免疫调节能力，对于修复组织缺陷及组织工程中作为种子细胞等方面都具有独特的优势[4]。因此，MSCs已在细胞治疗、基因治疗及组织工程等领域被广泛地研究与应用。目前研究较多的MSCs包括：骨髓来源MSCs、外周血来源MSCs、脐带来源MSCs、胎盘来源MSCs及羊水来源MSCs等[4]。脐带 MSCs具有与骨髓MSCs类似的生物学特征，然而其在增殖能力、分化能力等方面优于骨髓来源MSCs，同时两者在细胞因子的分泌上亦有所不同。脐带的来源较为广泛，并且相对骨髓而言取材明显便利，属于医疗废弃物，对供者无不良影响，同时异体移植无免疫排斥或排斥较弱，因此在临床应用上具有广阔的前景。近年来，干细胞治疗在基础研究领域获得了很大的进步，部分研究成果已开始在肿瘤疾病、自身免疫系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病等多种临床试验中得到应用，在临床研究方面也获得了许多临床数据，发表了许多干细胞临床研究与应用的相关报道[5]。目前脐带MSCs已被用于针对系统性红斑狼疮、帕金森综合征、类风湿关节炎、肾损伤、失代偿期肝硬化、肝衰竭等领域的研究治疗，并且还可以作为基因治疗的载体细胞[6-9]。MSCs还可用于治疗多种组织损伤性疾病，如脊髓损伤、急性心肌梗死等[10-11]。临床研究与应用中常用的细胞移植途径主要包括静脉输注、腹腔注射和局部注射等。

3 干细胞治疗卵巢早衰临床前资料

3.1 对免疫损伤型卵巢的修复作用 自身免疫异常是核型正常的卵巢早衰患者的重要病因之一。统计表明，大约20%的卵巢早衰是由于免疫系统不能识别自身卵巢组织所致，部分卵巢早衰患者血液中存在抗卵巢抗体，此类患者多伴有自身免疫性疾病，这类自身免疫性疾病常发生在卵巢早衰之前[12]。有研究人员利用猪卵巢蛋白主动免疫建立免疫损伤的小鼠卵巢模型，给模型及对照小鼠分别腹腔移植绿色荧光蛋白转基因小鼠的骨髓MSCs及等量的磷酸盐缓冲液，通过聚合酶链反应检测卵巢中绿色荧光蛋白基因，以判断MSCs是否到达卵巢；通过苏木精-伊红染色法、细胞凋亡等方法分析MSCs对损伤卵巢的修复作用，发现腹腔移植的MSCs可以顺利到达免疫损伤的卵巢组织；从卵巢结构上分析，MSCs移植后，作为研究靶向器官的免疫损伤卵巢部位逐渐观察到各级卵母细胞的增加；MSCs移植4周后，治疗组小鼠的卵巢各部分细胞形态与结构已恢复到与正常小鼠卵巢组织相似的水平，而对照组则与治疗前改变不明显，提示MSCs移植能显著促进免疫损伤小鼠卵巢结构的修复；MSCs移植可能通过大量分泌细胞因子等机制，显著减少免疫损伤卵巢颗粒细胞的凋亡[3]。

3.2 对化学损伤型卵巢的修复作用 MSCs不但对免疫损伤型卵巢早衰具有一定的修复作用，对化学损伤的卵巢早衰也具有一定程度的修复作用。有研究者用10%的双氧水损伤卵巢建立卵巢早衰小鼠模型，对模型小鼠和对照小鼠分别腹腔移植MSCs及输注等量的磷酸盐缓冲液，通过观察外观和病理切片的方法研究MSCs是否对化学损伤卵巢有修复作用，发现移植MSCs组较对照组卵巢功能恢复更快，同时各级生长的卵泡数量也明显多于对照组[13]。有研究者还使用局部注射方法将MSCs悬液注入去氧乙烯基环己烯所致的卵巢早衰模型小鼠双侧卵巢，观察MSCs分布及探讨卵巢早衰治疗的可行性；该研究观察了小鼠动情周期的变化、FSH与促黄体生成素的比值水平及移植后MSCs的分布等；结果显示，注入卵巢的MSCs主要分布在卵巢间质区，少量分布在卵巢泡膜细胞区；MSCs组动情周期较对照组缩短，FSH/促黄体生成素水平较对照组低，差异有统计学意义；即MSCs可以改善小鼠卵巢内分泌功能，并长时间存在于卵巢组织，一方面可能是MSCs分泌的细胞因子抑制了卵巢细胞的凋亡，并促进分泌类固醇激素细胞，另一方面可能是部分MSCs分化为卵巢细胞，替代受损细胞并促进组织修复[14]。综上所述，MSCs不仅对人为建立的卵巢早衰有修复作用，还能修复环境毒素对卵巢的损伤。

3.3 对放化疗损伤型卵巢的修复作用 导致卵巢早衰的物理化学因素主要包括化疗药物和放疗中的放射性照射等。卵巢接受化疗毒性药物及放射性照射后将直接破坏卵巢细胞及组织，可导致暂时或永久性闭经；损伤的病理表现主要包括原始卵泡和发育卵泡消失、管硬化、间质纤维化、玻璃样变以及门细胞储留等[15]。化疗是目前治疗肿瘤及某些自身免疫性疾病的主要手段之一，肿瘤年轻化和自身免疫性疾病好发于青年女性，使化疗所致的卵巢早衰成为临床关注热点。Rahhal和Eugster[12]报道了1例因治疗白血病患卵巢早衰在骨髓移植后8年卵巢功能恢复的病例。而Lee等[16]通过建立环磷酰胺所致的卵巢早衰小鼠模型，进一步证实了骨髓移植能治疗环磷酰胺所致不孕的雌性动物模型小鼠。付霞菲等[17]采用腹腔注射环磷酰胺建立化疗所致的大鼠卵巢早衰模型，建模成功后分实验组和对照组，采用局部给药方式给实验组双侧卵巢输注MSCs悬液，观察大鼠卵巢恢复情况发现，实验组大鼠在激素水平、动情周期、卵巢切片方面均有明显恢复，提示MSCs可一定程度修复环磷酰胺损伤的卵巢组织，甚至改善卵巢的内分泌功能。其前期研究也显示，MSCs能抑制环磷酰胺氮芥诱导的卵巢颗粒细胞的凋亡，MSCs可能通过这一途径保护受损卵巢组织[18]。朱少芳[19]对MSCs治疗化疗损伤的卵巢早衰作了进一步研究，比较了胎盘和脐带来源的MSCs的治疗作用；研究分别采用卵巢注射移植和尾静脉注射移植的不同方式，探索最合适的细胞来源和最合适的移植方式；实验结果提示，脐带MSCs较胎盘来源MSCs更适于临床应用；对于给药途径，卵巢注射组大鼠FSH恢复较快，生育较早，但实验后期达到均衡；考虑到静脉注射损伤部位小，可多次注射或提高体内脐带MSCs的浓度，也许可以获得更好的疗效，因此有望成为卵巢早衰治疗的新方式；实验还观察了实验大鼠生育的幼鼠生长发育情况，结果发现，经过细胞治疗的大鼠所产幼崽与正常组比无明显差异，提示脐带MSCs移植可能并不影响子代的生长发育状况。另外，多项研究已证实，体外条件下骨髓干细胞可以分化为性激素生成细胞，对雌小鼠进行骨髓移植和外周血干细胞移植可使被化疗药物白消安、环磷酰胺消除的卵母细胞受体卵巢中重新出现卵母细胞和卵泡[17-19]。骨髓干细胞移植可恢复失去生殖能力的性腺功能，表明其可能分化为性激素生成细胞。

4 可能的修复机制

MSCs有“归巢”属性，即通过原位、静脉或腹腔等途径移植后，可迁移定植于特定的损伤部位如卵巢，并能在卵巢内存活生长。上述动物实验研究表明，移植MSCs后造模动物的卵巢形态、大小及动情周期都得到一定程度的恢复，病理组织切片上可以观察到卵巢各级卵泡数明显增加，颗粒细胞生长，抗颗粒细胞凋亡，内分泌功能得到改善，甚至恢复受孕等。MSCs对于损伤组织的修复主要通过以下几种途径：①MSCs自身可分泌多种细胞因子(如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、类胰岛素一号增长因子等)，抑制细胞凋亡，修复受损组织细胞[20]；②MSCs定植于受损伤部位并进行分化，部分补偿或替代修复其功能；③通过免疫调节作用，抑制机体免疫反应，促进受损组织的自身修复；④MSCs可通过修复卵巢间质，防止卵巢纤维化，从而对受损卵巢起到保护作用；⑤MSCs进入损伤卵巢后可能直达损伤部位，并分化成部分血管内皮细胞，提供营养支持；⑥MSCs可能改变了一部分基因的表达，并通过基因的改变达到调控卵巢功能的作用[21]。

5 小 结

目前，临床MSCs治疗主要应用在①局部种植：Strauer等[22]报道了对1例急性心肌梗死患者进行MSCs移植治疗的研究，该研究首次证明选择性冠状动脉移植MSCs是可行的，并能在梗死心肌区使心肌再生；②系统移植：MSCs在血液疾病的治疗由来已久；③基因治疗：MSCs是基因治疗合适的靶细胞；④组织工程： MSCs为临床治疗提供了新思路，已经在心脏和神经修复等方面取得了可喜的成果。相信随着研究的逐步深入，将为卵巢早衰的治疗开拓新的途径。

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Research Advance in Stem Cell Therapy for Premature Ovarian Failure

LIUXue1,JIANATIQiu-waxi1,LIZhao-xi2,LIUMu-yun1,HUXiang1,SUFang-ming2.

(1.ShenzhenBeikeBiotechnologyCo,Ltd,Shenzhen518057,China； 2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,ShenzhenPeople′sHospital,Shenzhen518020,China)

Premature ovarian failure(POF) has become one of main causes for female sterility,and the morbidity is increasing year by year recently.It seriously affects the quality of life for patients and increases the economic burden of society.The causes and pathogenesis of POF is complicated,and still remains unclear.At present,hormone replacement therapy is the main method to control the development of the disease while there is still no ideal cure treatment for it.Stem cell therapy has been one of the research hotspots during recent years,and might have become a new method for POF treatment.Here is to make a review of the possible mechanisms of the treatment for POF by retrospectively analyze the pre-clinical data of stem cell therapy for POF caused by different reasons,in order to provide reference for further studies.

Premature ovarian failure; Stem cell; Repair

R711.75

A

1006-2084(2015)12-2151-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.014

2014-08-05

2014-11-25 编辑：郑雪