黏着斑信号通路调控肿瘤上皮间质转化的研究进展＊

吴艺舟严雨欣孙 杰

1 南京医科大学基础医学院细胞生物学系，江苏省南京市 210029； 2 南京医科大学口腔医学院2013级五年制口腔医学1班； 3 南京医科大学公共卫生学院，江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心

黏着斑信号通路调控肿瘤上皮间质转化的研究进展＊

吴艺舟1严雨欣2孙 杰3

1 南京医科大学基础医学院细胞生物学系，江苏省南京市 210029； 2 南京医科大学口腔医学院2013级五年制口腔医学1班； 3 南京医科大学公共卫生学院，江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心

上皮间质转化（EMT）是指上皮细胞在特殊病理条件下获得间质细胞特征的过程，也是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要前提。黏着斑是细胞与细胞外基质之间的主要连接方式，参与细胞运动与信号传导。本文综述了黏着斑信号通路通过直接或间接的方式调节EMT相关蛋白表达、细胞骨架重构等，从而影响EMT进程的分子机制，将为肿瘤转移治疗提供新的理论依据和治疗靶点。

黏着斑 上皮间质转化 肿瘤 侵袭转移 信号传导

癌症是全球发病和死亡的一个重要因素，找到有效的治疗措施对人类健康具有重大意义。肿瘤细胞侵袭、转移的过程是细胞黏着受体、胞外基质、生长因子和基质降解蛋白酶及其抑制物之间的复杂相互作用。目前认为上皮间质转化（Epithelial－mesenchymal transition，EMT）是肿瘤早期侵袭和转移的一个重要环节，上皮肿瘤的侵袭往往需要丢失细胞间的黏着物质、降解细胞膜的基础连接，促使细胞从上皮组织分离，最终在间质中运动[1］。EMT的概念最早在1982年被提出，是指上皮细胞在某些特殊的生理或病理条件下获得间质细胞特征的过程，即上皮细胞极性、细胞间黏附和细胞表面特异性标志物丧失，细胞间连接解体，细胞分散，运动能力增强，细胞骨架重构，进而获得间质样细胞表型的过程[2］。EMT的特征主要表现为（1）上皮标记物表达降低，如E－cadherin、keratin、Ep－CAM、β－catenin等；（2）立方上皮细胞的细胞角蛋白结构改变，细胞形态转变为纺锤形纤维细胞；（3）间质标记物表达增加，如vimentin、fibronectin、N－cadherin等；（4）诱导EMT的细胞因子和转录因子表达上调，如snail、slug、twist、TGF－β等[3］。

黏着斑（Focal adhesion，FA）是细胞与细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的主要连接方式，有利于维持细胞在运动过程中的张力以及细胞生存的信号传递，在EMT过程中发挥重要作用。FA的跨膜部分由integrin组成，integrin是一类跨膜连接蛋白，发挥fibronectin受体的功能，并通过fibronectin与ECM相结合。FA的胞内组成包括：talin、αactinin、filamin A和vinculin等，通过上述成员组成FA复合体与细胞骨架的微丝相连接[4］。

近年来，大量研究表明FA相关结构分子参与调控肿瘤细胞EMT进程，主要通过两个方面实现：（1）信号传递方面，FA信号通路通过调控上皮标记物、间质标记物和诱导EMT的细胞因子、转录因子的表达来调控EMT的进程；（2）机械结构方面，通过FA的不断解离和聚合，支持了肿瘤细胞运动能力增强、获得间质细胞表型并且发生EMT的过程[5］。

1 FA跨膜结构及胞外的相关分子

1.1 integrin 整合素（integrin）是组成FA结构的核心分子，在ECM和细胞骨架的连接中起桥梁作用，为细胞运动提供牵引力，从而促进细胞迁移[6］。integrin可通过不同信号途径诱导肿瘤细胞不依赖支持物生长、生存和运动，并且结合丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，促进肿瘤细胞侵袭和肿瘤血管的生成[7］。已有研究表明integrin可以通过多种方式直接或间接调控肿瘤细胞EMT进程。例如integrinα5β3在乳腺癌细胞的表达促进淋巴结和骨转移，并且在一些小鼠肿瘤和人类肿瘤上作为肿瘤干细胞的一个标志。Jay等人的研究发现，integrin可以促进slug表达和诱导人类乳腺肿瘤发生[8］。integrin也受到EMT信号通路的反馈调控。EMT转录因子zeb2可通过不依赖E－cadherin表达的方式直接上调integrinα5的转录。通过小干扰RNA抑制zeb2转录，可以降低integrinα5的表达并减少肿瘤细胞的侵袭。进一步研究发现，zeb2联合转录因子sp1共同结合到integrinα5和vimentin启动子区，上调两者转录，从而促进EMT发生[9］。

1.2 fibronectin 纤连蛋白（fibronectin）是ECM的重要成分，诱导肿瘤细胞的黏附、增殖和侵袭。在卵巢癌转移患者中检测到fibronectin表达升高，并且在腹水中也检测到了fibronectin。在侵入性卵巢肿瘤中，fibronectin在ECM、大网膜转移的皮下基底膜和腹水处高表达，并与不良临床预后相关。现已证实fibronectin可以特异性结合integrinα5β1，这将促进integrin聚集并触发胞内信号转导，同时也介导fibronectin在ECM的组装。Kenny等研究的结果表明，辅助化疗后阻断fibronectin与integrinα5β1的相互作用可以延缓肿瘤复发[10］。在研究卵巢上皮癌的上皮间质转化时，Lee等证实在卵巢癌SKOV－3细胞中，fibronectin与integrinα5β1结合并形成FA，通过肌动蛋白动力学产生机械力。当TGF－β诱导EMT后，增强的机械力足以打破fibronectin－integrin结合，促进细胞发生迁移、转移离开卵巢，而未发生EMT的肿瘤细胞则没有产生这种机械力。这些结果为研究卵巢癌细胞EMT过程中integrin与fibronectin结合的动力学作用提供了直接定量的证据[11］。

1.3 TNC 细胞粘合素C（Tenascin C，TNC）是一种六聚体的细胞外糖蛋白，与受体结合后能够介导多种细胞功能。Katoh等首先报道TNC可以诱导乳腺癌细胞进入EMT[12］。在随后的研究中进一步证实integrin作为TNC受体，参与诱导乳腺癌细胞进入EMT。通过定量PCR检测和免疫印迹方法，在MCF－7细胞中检测到integrinα5、α2、β1、β6亚基大量表达。通过TGF－β诱导细胞中integrinβ6的mRNA明显上调，而加入TNC作用后integrinβ6的蛋白表达进一步显著升高。免疫荧光结果显示在TNCTGF－β共作用后，integrinα5和β6共定位至FA处，并且数量升高。此外，联合采用integrinα5、β1和α5β6的各自抗体处理MCF－7细胞后，可以抑制由TGF－βTNC诱导的EMT。通过免疫组化检测乳腺癌临床样品中的integrin各类亚基，发现高表达integrinβ6的肿瘤细胞集中定位于富含TNC的基质区域。以上结果充分说明integrinα5β6和α5β1结合到TNC上，作为其必需配体诱导了乳腺癌细胞启动EMT[13］。

2 FA胞内结构的相关分子

2.1 FAK 黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）是一种非受体酪氨酸激酶，已被证实在多种肿瘤中高表达。FAK是integrin信号通路中连接integrin与下游信号分子的枢纽，处于细胞内多条信号转导通路的交汇点，能激活多条信号转导通路。integrin、FAK及talin等细胞骨架蛋白共定位组成FA，三者相互作用使FAK发生自磷酸化并部分活化，再与src形成信号转导复合物。src与FAK结合后能够相互激活，最终使FAK完全活化[14］。活化的FAK进而通过信号转导有关的分子如paxillin、Grb2、Cas、PI3K和STAT等，从而激活FAKRasMAPK、FAKPI3KAkt和FAKSTAT等多条EMT相关信号通路，通过cross talk的形式进一步参与调控EMT进程[7］。

2.2 ILK 整合素连接激酶（Integrin linked kinase，ILK）是一种FA连接子，属于丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。ILK参与调节细胞和ECM相互作用、肿瘤侵袭以及肿瘤细胞启动EMT。ILK通过与integrinβ1结合，能够介导细胞与ECM的连接，并激活PI3KAktGSK3通路[15］。Chan等研究表明ILK是TGF－β诱导EMT所必需的关键因子[16］。Zhao等用免疫组化的方法研究94例涎腺腺样囊性癌（Salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）样本中ILK、snail、E－cadherin和N－cadherin的表达，并分析它们与临床病理特征的相关性。研究结果显示，snail和N－cadherin的上调以及E－cadherin的下调，都与ILK过表达显著相关[17］。Chen等在肺癌细胞的过表达ILK，发现ILK可以诱导细胞出现纺锤状的EMT表型，同时伴随E－cadherin表达下调，vimentin、fibronectin、snail和slug的表达上调，这些结果表明ILK可以诱导肺癌细胞进入EMT，促进肺癌细胞迁移和侵袭[18］。

2.3 talin 踝蛋白（talin）是第一个被发现的肌动蛋白结合蛋白。talin能够直接结合integrin，并介导integrin与细胞微丝骨架的连接，在integrin－微丝骨架间的早期机械连接中发挥关键作用。每个talin分子含有2个integrin结合位点。一个位点在球形头部氨基末端，该区域还可结合FAK，参与细胞运动、增殖、抗凋亡、肿瘤转移等作用[19］。另一个位点在杆状部羧基端附近，该区域还包含11个vinculin结合位点以及actin结合位点[7］。杨红军等研究发现随着大肠癌组织浸润程度的加深，talin表达水平下降，表明talin表达与大肠癌的癌变、侵袭及转移有关[20］。talin表达水平的改变，可通过与integrin、FAK和其他细胞骨架蛋白的信号转导作用，调节细胞的迁移等功能，进而促进大肠癌的发生和发展。

2.4 vinculin 纽蛋白（vinculin）是一种肌动蛋白结合蛋白，其作用是在细胞之间或细胞－ECM的连接中将微丝骨架的actin锚定在细胞膜上，在细胞连接延伸及固定中发挥重要作用，同时也参与将细胞外信号向内传递[21］。vinculin还可以调节肿瘤细胞游离出肿瘤组织，转移到机体其他组织。已有研究证实vinculin的表达水平与食管癌的癌变、浸润及转移有关[19］。当vinculin表达降低，会导致细胞黏附力下降，微丝、微管的减少及解聚，从而促进肿瘤细胞在组织中迁移，预示着vinculin在EMT过程中发挥重要作用。Corina等报道vinculin的活化可以促进形成vinculintalinactin复合体[22］。Matthew等在研究乳腺上皮细胞转化和侵袭中发现，高表达的vinculin与乳腺癌恶性进展高度相关。通过vinculin激活Akt信号通路，可以促进乳腺上皮细胞的恶性进展。此外，vinculin与激活的Akt共定位在乳腺肿瘤的浸润边界，而此边界的ECM是刚性结构。由此可见刚性的ECM能够通过促进vinculintalinactin支架的组装来促进肿瘤的发展[23］。

3 FA通路下游的微丝骨架相关分子

3.1 F－actin 肿瘤细胞发生EMT时会出现典型的肌动蛋白纤维（F－actin）骨架重构，即微丝骨架重构（microfilament remodeling）。微丝骨架参与肿瘤细胞的EMT进程主要通过F－actin产生动力，而肌动蛋白结合蛋白发挥辅助作用[24］。Cao等使用免疫组化技术研究60例胰腺癌临床样品中EMT标志分子slug、E－cadherin和基质金属蛋白酶（MMP－9）的表达与肿瘤侵袭转移的关系，发现三者的表达量与淋巴结转移显著相关。进一步在胰腺癌细胞系PANC－1中发现F－actin和MMP－9主要分散在细胞核外围，当过表达slug后，F－actin和MMP－9表达上升并聚集定位在细胞的片层伪足前缘，参与细胞迁移。以上这些结果表明slug通过上调F－actin和MMP－9表达，诱导微丝骨架重构，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移[25］。

3.2 filamin A 细丝蛋白A（filamin A）是一种肌动蛋白结合蛋白，是细胞内分子的支架，参与细胞骨架形成、增殖调控、黏附及迁移等多种细胞行为，在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。filamin A与actin结合，调节F－actin重构，从而影响EMT过程中细胞的运动爬行[26］。吴艳萍等报道filamin A高表达可以促进乳腺癌的浸润和转移[27］。刘秀花等报道filamin A在发生血管神经浸润的晚期乳腺癌患者中呈现高表达，表明filamin A的表达与肿瘤浸润转移密切关联[28］。Flanagan等也证实filamin A可以促进黑色素瘤细胞的转移，而沉默filamin A表达可以抑制黑色素瘤细胞的迁移[29］。

3.3 α－actinin 辅肌动蛋白（α－actinin）是一种肌动蛋白连接蛋白，参与调节F－actin的装配，并将F－actin与多种跨膜受体如integrin等相连接。Pavalko等研究发现α－actinin在介导integrinF－actin形成FA结构中发挥重要作用[30］。在结肠、胰腺、卵巢和大脑中发现，α－actinin 4的表达增加与晚期癌症和转移性癌症有很强的关联。α－actinin 1或α－actinin 4的低表达都会抑制乳腺癌细胞的迁移，而过表达α－actinin 4则可以促进细胞迁移[31］。此外，已有研究表明体外培养的肿瘤细胞在迁移时，α－actinin与vinculin之间存在协同分布，相互调节以适应细胞形状及功能状态的变化，两者共同参与细胞黏附和细胞迁移[32］。虽然目前尚无研究证明二者直接参与调控EMT进程，但存在潜在机制即α－actinin与vinculin相互作用影响黏着斑信号通路与F－actin重构，从而调控肿瘤细胞进入EMT。

3.4 fascin 肌动蛋白交联蛋白（fascin）作为一种肿瘤标志物在多种肿瘤中表达上调，可以促进肿瘤细胞丝状伪足的形成。Fascin集中在癌组织的前缘，稳定伪足，并且介导肿瘤细胞迁移。沉默fascin的表达不仅降低了肿瘤细胞的迁移力，也降低了肿瘤细胞的侵袭力[33］。Ang等证实fascin高表达与胰腺导管腺癌的形成和预后相关[34］。高表达的fascin可以通过上调MMP－2促进胰腺导管腺癌细胞的迁移和侵袭。而fascin调节MMP－2的表达是通过蛋白激酶C（PKC）与细胞外信号调节激酶共同作用实现[35］。侯俊清等发现随着肿瘤恶性程度的升高，fascin蛋白阳性率及表达量均增加，同时EMT标志分子E－cadherin的表达量降低。这说明fascin参与肿瘤的侵袭及恶性转化，预示fascin可能通过抑制E－cadherin的表达来发挥作用，但两者之间的调控机制尚不明确[36］。

3.5 α－SMA α－平滑肌肌动蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）参与细胞的运动和细胞形态的维持，是构成细胞骨架的主要成分。Ding等研究发现α－SMA阳性表达的成纤维细胞在肿瘤发展和转移中发挥关键作用。α－SMA阳性表达的成纤维细胞通过诱导EMT促进肿瘤细胞的转移，同时该类细胞通过产生多种趋化因子来调节形成转移微环境[37］。潘延凤等报道α－SMA表达量与患者预后相关，且α－SMA高表达的肿瘤细胞具有间质细胞的特征[38］。Lee等报道α－SMA调节肺腺癌细胞中FAK的表达，增强肿瘤细胞的转移潜能。由此可见，α－SMA可以作为预示肿瘤细胞发生EMT和增强侵袭力的标志分子[39］。

综上所述，由FA的跨膜结构相关分子、胞内结构相关分子和下游微丝骨架分子构成的信号通路，直接或间接作用于EMT，调控肿瘤细胞的EMT进程。进一步研究黏合斑信号通路不仅为揭示EMT的调控机制提供新的思路，也将为肿瘤转移治疗提供新的理论依据和治疗靶点。

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R73

A

1001－7585（2015）19－2601－04

2015－03－23

（编辑羽飞）

江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；南京医科大学科技发展基金重点项目（2012NJMUZD018、2014NJMUZD004）。通讯作者：孙杰