大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

张爱霞

1.嘉应学院生命科学学院，广东梅州 514015； 2.中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心，广东中山 510080

BMSCs 作为多能干细胞的一种，由于其取材方便，具有多向分化潜能，有较弱的免疫抗原性，体内植入反应较弱，正逐渐受到学者们的广泛关注。BMSCs 不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等[1-2]中胚层来源的细胞，它还具有强大的横向分化潜能，除了向间质组织分化外，BMSCs 还可跨越胚层限制向外胚层的神经元、神经胶质细胞等外胚层分化，向胰岛样细胞、肝细胞等内胚层来源的细胞分化。BMSCs 的细胞增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达，BMSCs 已成为重要的再生医学种子细胞[3-4]，具有重要的临床应用前景。

体外成功分离培养BMSCs 是实验研究和临床应用的重要前提。该实验应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs，并观察其生物学特性及成骨和成脂的分化潜能，为BMSCs 的体内外研究应用奠定基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

4~6周龄SPF 级SD 大鼠，雌雄不限，体重100~150 g，购自中山大学中山医学院实验动物中心。

1.2 实验试剂

L-DMEM 培养基、H-DMEM 培养基均购自美国GIBCO BRL公司；胎牛血清（FCS）、胰蛋白酶均购自Hyclone 公司；Vitamin C、 地塞米松、 牛胰岛素均购自Sigma 公司；β-甘油磷酸钠购自Calbiochem 公司。兔抗大鼠单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45- PE-Cy5 购自BD phamingen 公司。

1.3 大鼠BMSCs 的体外分离、培养与纯化

取SPF 级3～4 周龄SD 大鼠，断颈处死，75%酒精浸泡5 min。无菌条件下分离大鼠双侧股骨，并彻底清除附着其上的肌肉组织，去除两端骨骺，用含10%胎牛血清的L-DMEM 间质干细胞培养液反复冲洗骨髓腔，收集细胞，1 100 r/min 离心5 min, 弃去上清及脂肪层。以2×105 cells/cm2的密度接种于培养瓶中，置于培养箱中培养。培养48 h 后首次换液，以后每3 d 换液1 次，每天观察细胞的形态及生长情况。

1.4 流式细胞仪检测细胞表面标记

收集第3 代细胞，调整细胞密度为1.0×106个/mL，装入1.5 mL的EP 管中，每管1 mL，1100 r/min 离心4 min，弃上清。每管加入100 μL PBS，混匀，分别加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5兔抗大鼠单克隆抗体1 μL（0.5~1 μg/106 细胞），混匀。37 ℃避光孵育20 min 后，每管加入1 mL PBS，1100 r/min 离心4 min，弃上清，再重复洗2 遍，以除去未结合抗体。0.5 mL PBS 重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。同时每管样品设立同型阴性对照。

1.5 体外诱导大鼠BMSCs 成骨和成脂分化

1.5.1 成脂分化及油红O 染色鉴定 取第3 代的大鼠BMSCs 接种于六孔板，加入含1 umol/L 的地塞米松，0.5 mmol/L 的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，10 mg/L 的牛胰岛素，100 mmol/L 的消炎痛(indomethncin)，10%FCS 的H-DMEM 诱导3 d，再用含10 mg/L的牛胰岛素，10%FCS 的H-DMEM 处理1 d，镜下观察细胞形态的变化和生长情况。成脂诱导后的细胞用PBS 洗涤3 次，10%多聚甲醛固定10 min，油红O 染色5~10 min，60%异丙醇稍洗去多余染液，蒸馏水洗，Mayer 氏苏木素浅染核，1%盐酸水稍分化，水漂洗10 min。于倒置相差显微镜下观察。

1.5.2 成骨分化及茜素红S 染色 取第3 代的大鼠BMSCs 接种于六孔板，加入成骨细胞诱导液 （含10~7 mol/L 地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50 g/mLVitamin C）2 mL，置培养箱中培养。诱导分化18 d 后，吸去成骨细胞诱导液，用PBS 洗涤3 次，然后加入适量的茜素红-S 染液染10~15 min，显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 BMSCs 的形态学观察

原代培养时，骨髓细胞接种于培养瓶后，细胞呈圆型，悬浮于培养液中。培养24 h 后即有细胞贴壁，换液后可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长，第4～5 d 可形成分散的细胞集落，细胞形态不一，梭形细胞为主，见图1A。第8～9 d 细胞呈集落生长，细胞间相互紧密贴附生长，沿胞体长轴有序排列，呈螺旋状或漩涡状，可达80%~90%融合，见图1B。消化传代后，传代细胞12 h 完全贴壁生长，3～4 d 可传代1 次。传代至第3 代的细胞形态均一，呈梭形生长，见图1C。

图1 不同时期骨髓间质干细胞的形态学观察（×100）

2.2 BMSCs 表面标记物的表达

流式细胞仪检测结果显示，培养的第3 代大鼠BMSCs CD29、CD44 表达阳性，而CD45 呈阴性，见图2。

图2 大鼠骨髓间充质干细胞表面标志物的表达

2.3 BMSCs 成脂成骨诱导分化及鉴定

BMSCs 加入脂肪诱导液诱导2 周后，细胞中有大小不等的脂肪滴出现，细胞逐渐由原来的梭形变为圆形或多角形，经油红O 染色，苏木素复染核，镜下观察可见脂滴为橙红色，胞核为蓝色，见图3A。BMSCs 经成骨诱导液诱导2 周后，细胞转变为多角形细胞，呈多层重叠生长，可观察到较大的细胞结节，有明显的钙沉积，茜素红S 染色后镜下可见散在大量橘红色的钙结节，为茜素红与钙盐形成的橘红色的复合物，见图3B。

图3 大鼠骨髓间质干细胞成脂成骨诱导分化鉴定

3 讨论

骨髓间质干细胞是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分。BMSCs 在全骨髓中比例很低，只占骨髓有核细胞总数的0.001%～0.01%[9]。目前已经建立了多种体外分离培养BMSCs 的方法，主要有全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法，不同的方法具有不同的优缺点[1，10]。全骨髓贴壁培养法基于BMSCs 的粘附特性，是获得这种细胞的最简单方法。本实验采用的是全骨髓贴壁培养法，用L-DMEM + 10% FBS 作为基本培养基，通过反复、 多次换液去除未贴壁的造血干细胞，获得贴壁生长的BMSCs，通过传代进行纯化和扩增培养。研究显示，体外培养的BMSCs，在形态上呈纺锤形成纤维细胞状，能贴壁生长，呈螺旋状或漩涡状[11]。该研究也证实了上述观察结果。

BMSCs 的多向分化潜能受到多种因素的影响，研究表明，MicroRNA-9-1 可增加BMSCs 向神经细胞的分化比率[12]，熟地含药血清能够促进BMSCs 向神经细胞的分化[13]。王贞等[14]研究发现，人血小板裂解液可以促进BMSCs 成骨分化，抑制其成脂分化，朱小虎等[15]证实硝酸甘油也可促进BMSCs 向成骨分化。BMSCs 的疾病治疗方面也得到广泛的研究，并取得较好的实验结果，BMSCs 经BMP-2 预诱导后移植治疗大鼠再灌注后心肌梗死，对心肌梗死再灌注损伤有一定治疗作用[16]。BMSCs 联合脑源性神经营养因子用于大鼠脑出血的实验研究发现[17]，移植后可促进大鼠脑出血损伤部位结构和功能的修复。

该研究利用骨髓全贴壁培养法成功分离培养了大鼠BMSCs，所得细胞具有间质干细胞的生物学特性，具有多向分化潜能，这将为进一步的实验研究和应用打下坚实的基础。

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