汉黄芩素对人结肠癌HT-29细胞增殖及STAT3信号转导通路的影响※

魏国丽 周 宇

汉黄芩素对人结肠癌HT-29细胞增殖及STAT3信号转导通路的影响※

魏国丽 周 宇

目的 探讨汉黄芩素对体外培养人结肠癌HT-29细胞增殖及STAT3 信号转导通路的影响。方法 取对数生长期HT-29细胞，经30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L和120 μmol/L不同浓度的汉黄芩素处理24 h和48 h后，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定不同时间和不同浓度汉黄芩素对HT-29细胞增殖的影响；不同浓度汉黄芩素作用HT-29细胞48 h后，采用RT-PCR方法检测STAT3信号转导通路中髓样细胞白血病-1（Mcl-1）、抗凋亡蛋白（Bcl-xl）和原癌基因信使RNA（c-Myc mRNA）表达水平。结果 汉黄芩素抑制HT-29细胞增殖，且随作用时间、浓度增加，细胞增殖抑制率逐渐上升；经不同浓度汉黄芩素处理HT-29细胞48 h后，Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc基因mRNA表达水平明显下调，各浓度汉黄芩素组与空白对照组及组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 汉黄芩素体外可呈时间-浓度依赖性抑制人结肠癌细胞的增殖，这可能与下调STAT3信号转导通路中Mcl-1、Bcl-xl、c-Myc mRNA表达水平有关。

汉黄芩素；HT-29细胞；细胞增殖；STAT3 信号转导通路

汉黄芩素（wogonin）是中草药黄芩中提取的一种具有抗肿瘤与免疫增强、抗病毒、抗氧化、降血脂等广泛生物学活性[1]的天然黄酮类化合物。研究发现，肿瘤的发生、发展与转录激活因子3（STAT3）细胞信号转导系统异常密切相关，然而汉黄芩素对结肠癌细胞增殖及 STAT3信号转导通路是否有影响，尚未见文献报道。本文旨在探讨汉黄芩素对结肠癌细胞作用的可能机制，为汉黄芩素的抗癌作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 汉黄芩素纯度＞99%，购自上海友思生物技术有限公司；另外自中南大学湘雅中心实验室采购人结肠癌HT-29细胞株作为实验材料；实验用的RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物制品公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自武汉博士德生物工程有

限公司；胰蛋白酶（trypsin）、二甲亚砜（DMSO）购自美国Amresco公司；荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物技术有限公司，PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞传代培养 将人结肠癌HT-29细胞接种在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于温度为37 ℃、CO2浓度为5%的孵育箱中饱和湿度下培养，细胞呈单层贴壁生长，待细胞生长接近80%时，收集对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性 以每孔1×104/ml的细胞密度接种于96孔板上，200 μl/孔。待细胞贴壁后，汉黄芩素组分别加入不同浓度汉黄芩素（30、60、90、120 μmol/L），空白对照组加无血清的RPMI 1640培养液（不含聚酰胺）。作用24、48 h后弃上清，加入无血清的RPMI 1640培养液180 μl，同时每孔加入MTT（5g/L）20 μl，37 ℃继续培养4 h。离心，弃孔内上清液后，加入DMSO 150 μl 振荡10 min，使沉淀充分溶解；用酶标仪检测490 nm波长下的吸光度（A）值，记录结果。计算公式：细胞增殖抑制率＝（空白对照组吸光度－汉黄芩素组吸光值）/空白对照组吸光度×100%。重复实验3次。

1.2.3 RT-PCR法检测髓样细胞白血病-1（Mcl-1）、抗凋亡蛋白（Bcl-xl）和原癌基因信使RNA（c-Myc mRNA）表达水平常规培养细胞，取对数生长期HT-29细胞接种于 6孔板，密度为 2×105个细胞/孔。依照汉黄芩素浓度（30、60、90、120 μmol/L）分为4组，培养24 h后进行药物干预，继续培养48 h后，用Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，以β-actin基因为内参，鉴定cDNA模板的完整性，分光光度法测定计算总RNA含量及浓度。实时荧光定量PCR体系20 μl，其中SYBR Premix Ex Taq（2×）10.0 μl，上、下游引物各0.4 μl（10 μmol/L），cDNA 2.0 μl，蒸馏水H2O 7.2μl。反应条件如下，95℃预变性10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 5 m，40个循环。采用2－△△Ct相对定量法比较各组mRNA相对表达量。根据GenBank数据库查找基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，见表1。

表1 汉黄芩素处理后HT-29细胞进行RT-PCR检测相关基因的引物序列

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉黄芩素对细胞增殖的影响 各浓度汉黄芩素组与空白对照组及组间比较，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），随着汉黄芩素作用时间延长、浓度逐渐增加，细胞增殖抑制率逐渐上升，见表2。

表2 汉黄芩素对HT-29细胞增殖的影响

2.2 汉黄芩素对Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc的mRNA表达影响 经不同浓度汉黄芩素处理 48 h后，Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc基因mRNA表达水平明显下调，汉黄芩素对Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc mRNA表达均有抑制作用，各浓度汉黄芩素组与空白对照组及组间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 汉黄芩素对Mcl-1、Bcl-xl、c-Myc mRNA表达的影响

3 讨论

研究发现，汉黄芩素对胃癌等多种肿瘤细胞株的增殖有明显的抑制作用，且作为增敏剂可协同化疗药物增强抗癌活性[2]。也有研究认为，汉黄芩素可通过调节免疫细胞表型，阻滞细胞周期，抑制端粒酶活性和抑制血管生成等，进而抑制肿瘤细胞的增殖与转移，促进肿瘤细胞自噬与凋亡。另外，汉黄芩素还可以通过上调胞内ROS水平及p53信号，调节MAPKs分子，抑制核因子-κB活性等途径，影响多种信号通路，其抗肿瘤作用机制与细胞信号转导密切相关[3]。

STAT3信号转导通路与细胞增殖和凋亡密切相关，其重要转录因子STAT3是存在于细胞质与酪氨

酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白，具有致癌潜能，其过度激活将导致细胞过度增殖与凋亡障碍，且其表达和活化与胃肠道肿瘤密切相关[4]。

本研究发现，应用汉黄芩素干预结肠癌 HT-29细胞24 h和48 h后，不同时间各浓度汉黄芩素组细胞增殖抑制率比空白对照组明显增高，差异有统计学意义，说明汉黄芩素可能有抑制结肠癌HT-29细胞增殖作用。研究还发现，增加汉黄芩素的作用浓度，其对HT-29细胞增殖的抑制作用更明显，呈浓度依赖性，这为临床应用汉黄芩素治疗结肠癌的最佳剂量筛选提供了实验依据。

本研究也发现，经不同浓度汉黄芩素干预HT-29细胞 48 h后，各浓度汉黄芩素组 Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc基因mRNA表达水平明显下调，分别与空白对照组及组间比较差异有统计学意义，说明汉黄芩素可能通过降低Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc诸基因表达水平而发挥对结肠癌 HT-29细胞的抑制作用，STAT3信号转导通路活性增高可能与结肠癌密切相关。STAT3靶基因产物包括影响细胞凋亡的Bcl-2家族成员，Mcl-1、Bcl-xl均为Bcl-2凋亡家族成员中主要的抑凋亡分子，在结肠癌组织中高表达，抗凋亡基因Mcl-1具有抑制凋亡、维持细胞生存作用，但目前在结肠癌方面研究较少[5]。抑制凋亡蛋白Bcl-xl在癌组织中表达增强，且与淋巴结转移有关，可反映结肠癌的恶性程度，作为结肠癌基因治疗的靶点[6]。细胞周期调节因子 c-Myc是STAT3分子的下游靶基因，在肿瘤组织中明显高表达，c-Myc的失活可作为肿瘤细胞凋亡的标志[7]。本研究结果表明，汉黄芩素可下调Mcl-1、Bcl-xl和 c-Myc表达水平，抑制 HT-29细胞增殖，为STAT3通路与肿瘤分子靶向治疗的相关研究提供实验依据。

[1] Polier G,Giaisi M,Köhler R,et al.Targeting CDK9 by wogonin and related natural flavones potentiates the anti-cancer efficacy of the Bcl-2family inhibitor ABT-263[J].Int J Cancer,2015,136(3): 688-698.

[2] Salvatore Chirumbolo.Anticancer properties of the flavone wogonin[J].Toxicology,2013,314(1):60-64

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Effects of Wogonin on Proliferation and STAT3 signal Transduction Pathway in Human colon Carcinoma Cell line HT-29

Wei Guoli Zhou Yu

Objective The study is to explore the effects of wogonin on proliferation and STAT3 signal transduction pathway in human colon carcinoma cell line HT-29.Methods Human colon carcinoma cell line HT-29 of logarithm vegetal period were cultured with different density of wogonin(30,60,90,120μmol/L) for 24 hours and 48 hours,the effects of diverse density of wogonin on HT-29 cell proliferation was assayed separately by MTT method at different time;and after 48 hours of different concentration wogonin action,the expression of Mcl-1,Bcl-xl and c-Myc mRNA was measured by fluorescent quantitative PCR respectively.Results Wogonin restrained the HT-29 cell proliferation, What’s more,with the increase of wogonin action time and concentration,the suppression rate of cell proliferation was gradually rising up.Intervened by the different concentration wogonin in HT-29 cell for 48 h,the expression of Mcl-1, Bcl-xl and c-Myc mRNA in every wogonin groups was reduced significantly.What’s more,there was statistical difference among the wogonin groups and the control group(P＜0.05).Conclusion Wogonin could inhibit the proliferation of HT-29 cells in a time and density-dependent manner,and it could possibly contribute to reduce Mcl-1,Bcl-xl and c-Myc mRNA expression levels in STAT3 signal transduction pathway.

Wogonin;HT-29;Proliferation;STAT3 signal transduction pathway

R735.3+4

A

1673-5846(2015)06-0032-03

广东医学院附属医院消化内科，广东湛江 52400

2014年湛江市科技攻关计划项目（项目编号：2014B01081）

作者信息：魏国丽（1978.10-），研究生，副教授。主要从事消化内科学方向的研究