药用人血浆蛋白制备的研究进展

杜彬荣

(浙江省绍兴市第二医院中药房，绍兴 312000)

药用人血浆蛋白制备的研究进展

杜彬荣

(浙江省绍兴市第二医院中药房，绍兴 312000)

人血浆蛋白制品的经典制备方法是低温乙醇法。目前，国际上已成功对最初的低温乙醇法工艺进行了改良，相关研究方兴未艾。该文综述适应证最广、所占市场份额最大的四大类8种药用人血浆蛋白，如清蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子Ⅷ、人凝血因子Ⅸ、人凝血酶原复合物、α1-抗胰蛋白酶、人抗凝血酶Ⅲ、人蛋白C等的制备进展。

血浆蛋白；清蛋白；免疫球蛋白；凝血因子

药用人血浆蛋白制品是血液制品的一个分支，是从人类血浆中分离制备的具有临床意义的蛋白制品的总称。单一蛋白制品具有生物活性效价高、疗效可靠、纯度高、使用安全、稳定性好等特点。目前，已经有200多种人血浆蛋白被认定具有独特的生物功能，但只有20多种人血浆蛋白实现工业化制备[1]。对人血浆蛋白制品的进一步研究开发，对其工艺的进一步改进，可使其在现代医学中发挥更加重要的作用。

1 清蛋白制品

清蛋白的分离纯化也一直是血液分级制备中的研究热点。低温乙醇法(Cohn法)是由美国的Cohn等开发，它作为分离清蛋白的经典方法，具有重要的历史地位[2]。该方法的原理是依靠乙醇逐级沉淀血浆，将血浆分为若干个沉淀组分，简称为Cohn组分，根据沉淀产生的不同阶段将组分编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等。经过乙醇沉淀，已经对各类蛋白进行有效地粗分离，然后进$一步纯化各部分沉淀(包括Cohn沉淀Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等)中的蛋白获得蛋白纯品。清蛋白存在于沉淀Ⅴ中，现阶段一般采用在Cohn法基础上发展起来的Kistler-Nitschmann法[2]对清蛋白进行纯化。将层析技术引入到低温乙醇法中，可以提高清蛋白的回收率和纯度，克服单纯低温乙醇法所得蛋白纯度不够高的缺点。国内报道经凝胶柱层析和超滤后的清蛋白纯度可以达到99.8%，而层析之前的清蛋白纯度仅为91.0%[3]。目前，杨晓波等[4]在经典的Cohn法中引入萃取技术分级血浆，研究发现该方法降低了稀释倍数，减少了乙醇用量，保持了清蛋白的天然活性，提高其纯度。

2 人免疫球蛋白制品

根据免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)的氨基酸组成和排列不同，可分为人免疫球蛋白M(IgM)、人免疫球蛋白A(IgA)、人免疫球蛋白D(IgD)、人免疫球蛋白E(IgE)、人免疫球蛋白G(IgG)五大类，其中IgG是再次免疫应答的主要抗体，具有重要的免疫效应，在机体抗感染中起了主要作用。

低温乙醇法是制备IgG的主要方法，目前，绝大多数厂家都采用这个方法。改变Cohn法中的沉淀Ⅱ和Ⅲ的pH、温度、离子强度、蛋白浓度等条件，能够分离得到人免疫球蛋白沉淀物。层析制备人免疫球蛋白能够大大提高蛋白纯度。三步层析法制备人免疫球蛋白，经预处理的血浆分别通过DEAE-Sepharcose CL-6B、lysine-Spharose 4B、SP-Spharose 4B三个层析柱，洗脱所得的免疫球蛋白纯度接近100%[1]。目前，有学者采用载有 ω-aminodecyl的琼脂糖层析柱，在中性pH条件下一步纯化得到免疫球蛋白，证明这种以离子交换和疏水效应同时起作用的层析柱可以高效纯化免疫球蛋白[5]。

3 凝血因子类制品

3.1 人凝血因子Ⅷ 凝血因子Ⅷ也称为血友病球蛋白，是内源性凝血途径中的一种重要凝血因子。凝血因子以异二聚体和血管性血友病因子结合形成的复合物形式存在于体内。

鉴于人凝血因子的稳定性较差，适宜采用较温和的纯化方法。国外有学者将经冷沉淀处理后的血浆，通过DEAE-Fractogel层析得到人凝血因子Ⅷ，这种高效率的离子交换层析技术与S/D病毒灭活处理的相容性较好，已被推广到工业化制备人凝血因子Ⅷ[1]。将血管性血友病因子的单克隆抗体耦联至层析住上，最后用高浓度的钙离子洗脱人凝血因子Ⅷ，这种免疫亲和层析技术利用特异性亲和作用，使得该分离技术在制品纯度上具有明显优势。尽管免疫亲和层析制备凝血因子Ⅷ已经得到了工业化应用，但是仍存在亲和柱使用寿命不长和亲和配基污染的问题。菅长永[6]在制备工艺中引入了DEAE-Sephadex A50凝胶层析柱，可以吸附去除酸沉淀后上清液中的人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ部分纤维蛋白原和大部分纤维结合蛋白。用该工艺代替经典的氢氧化铝[Al(OH)3]吸附法，除有效减少上清液中人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及纤维结合蛋白之外，还避免了铝离子的引入，从而增强人凝血因子Ⅷ制剂的安全性。康丽梅等[7]用超大孔离子交换色谱纯化所得人凝血因子Ⅷ的回收率高达85%，加快了分离速率，蛋白比活力达到154 U·mg-1，该纯化工艺步骤少，并且易于放大。

3.2 人凝血因子Ⅸ 利用多步层析法，配合超滤、脱盐、浓缩纯化人凝血因子Ⅸ(FⅨ)的方法，所制备的人凝血因子Ⅸ的纯度较高；利用亲和层析法生产高纯度FⅨ的工艺已经比较成熟。

3.3 人凝血酶原复合物 该复合物主要含有人凝血因子Ⅸ(FⅨ)、人凝血因子Ⅹ(FⅩ)、人凝血因子Ⅱ(FⅡ)、人凝血因子Ⅷ(FⅧ)。通过无机盐吸附剂和离子交换层析是纯化人凝血酶原复合物的主要手段。由于凝血酶原复合物中4种成分的等电点较低，目前世界上绝大多数工厂采用DEAE-Sephadex A50层析制备人凝血酶原复合物。将加入了枸橼酸盐的血浆和去冷沉淀的血浆作为分离原料，通过调整吸附条件和洗脱条件可以改变人凝血酶原复合物中4种人凝血因子的含量和FⅨ的比活力。熊莹等[8]对大孔阴离子树脂分离制备人凝血酶原复合物的条件进行了优化，发现分别在人凝血酶原复合物中加入蛋白保护剂蔗糖和甘露醇，可以显著提高人凝血酶原复合物的活性。LIHME等[9]建立了一种以DEAE-tungsten carbide agarose为介质的扩张吸附床来制备人凝血酶原复合物的工艺，整个工艺过程耗时4.8 h，制备所得的复合物含FⅡ、FⅨ和FⅩ，不含有FⅦ。曹海军等[10]通过正交实验法优化了制备人凝血酶原复合物的工艺条件包括pH、柠檬酸钠浓度、氯化钠浓度及电导率，研究发现对于不同分析方法，结果有一定差异。

4 蛋白酶抑制剂

4.1 α1-抗胰蛋白酶 α1-抗胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，占血浆中抑制蛋白酶活性的90%，在Cohn组分Ⅳ中加入氯化锌，沉淀后经离子交换层析，最后去除病毒完成α1-抗胰蛋白酶抑制剂的制备，目前该工艺已经实现了工业化。KUMPALUM等[11]利用金属螯合层析技术有效分离了α1-抗胰蛋白酶和清蛋白这两种等电点接近的血浆蛋白，然后用交换层析进一步纯化，该工艺没有损失α1-抗胰蛋白酶的活性。庄明强等12]在Cohn组分Ⅳ中加入1，4-二硫苏糖醇，破坏杂蛋白的稳定性，再用二氧化硅吸附去除杂蛋白。富含α1-抗胰蛋白酶的滤液经过压滤、离子交换层析和疏水层析，所制备的α1-抗胰蛋白酶的纯度为97.6%，回收率为21%。叶生亮等[13]建立了一种依次经过阳离子交换层析和阴离子交换层析的工艺来制备，该工艺制备的α1-抗胰蛋白酶比活性高达0.94 pU·mg-1。

4.2 人抗凝血酶Ⅲ 制备人抗凝血酶Ⅲ的经典方法是将Cohn组分Ⅰ的上清液或组分Ⅲ沉淀的溶液通过肝素亲和层析柱分离纯化，再经巴氏消毒、纳米膜过滤，最后分装冻干制得冻干人抗凝血酶Ⅲ制品。杨晓波等[4]将Heparin-Hyper D引入到亲和层析中，大大提高了层析容量和流量。穆成华等[14]自制了一种琼脂糖凝胶6FF，并在此基础上还原胺化制备了肝素琼脂糖凝胶6FF介质。用该介质来分离抗凝血酶Ⅲ，研究发现当肝素配基的含量为2.7 mg·mL-1时，从人血浆中纯化所得的抗凝血酶Ⅲ活性回收率为31.76%。

4.3 人蛋白C 人蛋白C的理化性质与其他维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶比较接近，这也给人蛋白C的纯化带来了很大的难度。现代纯化技术已经淘汰了最初的钡盐吸附法，取而代之的是逐步层析法，特别是其中的亲和层析技术显著提高了人蛋白C的纯度。RADOSEVICH等[15]提出了一种依次通过DEAE-Sephadex A-50、DMAE-Fractogel MED，Heparin-Sepharose CL-6B层析柱，再经超滤脱盐、浓缩，最后滤菌冻干制得冻干人蛋白C的方法。在国内，沈永才等[16]采用相似的技术路线纯化蛋白C，所制备的蛋白纯度达到90.63%，为实现工业化制备做了前期的探索。王宗奎等[17]将离子交换层析与金属螯合亲和层析串联起来，纯化所得的人蛋白C总活性回收率达到(28.77±9.45)%，纯化倍数达(136.64±6.82)，比活性为(11.70±0.89) U·mg-1，表明该工艺可以制备比活性较高的人蛋白C。

5 展望

国际上，已有提出利用线性规模制备电泳技术来制备血浆蛋白。线性规模制备电泳技术是一种线性规模化的毛细血管制备电泳技术。该技术利用血浆蛋白的电荷和分子大小的差异达到分离纯化的目的，它的优势在于分离时间短、产品纯度高、蛋白回收率高、蛋白生物活性保持良好。线性规模电泳技术在制备高纯度制剂方面比层析技术有着明显的优势，但是推广到工业化尚缺乏成熟的设备。

亲和层析技术与其他层析技术比较，其优势在于特异性地选择和吸附目标蛋白，所制备的蛋白的纯度高。该技术的关键是获得理想配基。仿生亲和层析通过两种技术来获得理想的配基，其一是噬菌体显示技术，在短时间内产生大量多肽和小分子，并表达在噬菌体末端。一旦发现潜在配基，可以通过变异结合位点的氨基酸获得理想的配基。最后通过基因重组技术合成所需配体。其二是组合化学技术，结合生物物理学、晶体学等技术，用计算机分析蛋白空间结构，再根据生物物理学和生物化学原理设计合理的理想配基。

目前，我国的血浆综合利用率不高，药用血浆蛋白品种较少，与国外的差距较大。随着人们对血浆蛋白临床应用的认识不断深入，越来越多的药用血浆蛋白正在进步开发。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.022

2013-07-12

2013-12-04

杜彬荣(1981-)，女，浙江绍兴人，药师，学士，研究方向：生物工程。电话：(0)13385851005，E-mail： zucc_zbj@163.com。

R977.8；R943

A

1004-0781(2015)01-0081-03